[發(fā)明專利]一種用基因工程共固定化木聚糖降解酶制備低聚木糖和木糖的方法

有效

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• 申請日: 2012-04-24
• 公開（公告）號: CN102634558A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛業(yè)敏;武溪溪;張靜靜
• 申請（專利權(quán)）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/02;C12N11/10
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種基因工程共固定化木聚糖降解酶制備木糖的方法，其特征是首先制備基因工程共固定化木聚糖降解酶，然后用共固定化木聚糖降解酶水解木聚糖溶液或農(nóng)林廢棄物的汽瀑液，即可得到低聚木糖和木糖。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述基因工程共固定化木聚糖降解酶，由載體和帶有在高溫下結(jié)合力強的高效穩(wěn)定親和標簽結(jié)構(gòu)的系列木聚糖降解酶組成，其中該高效穩(wěn)定親和標簽結(jié)構(gòu)與幾丁質(zhì)類載體特異性地結(jié)合，從而使系列木聚糖降解酶共固定在載體上。

3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的系列木聚糖降解酶是由β-1.4內(nèi)切木聚糖酶、α-阿拉伯糖苷酶，β-木糖苷酶和α-D-葡萄糖醛酸酶組成。

4.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的幾丁質(zhì)類載體，是幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)珠或其他殼質(zhì)類產(chǎn)品。

5.按照權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于所述的高效穩(wěn)定親和標簽結(jié)構(gòu)的氨基酸序列為EWASNTYYKIGDLVTYNGITYKCIQAHTSLVGWEPPNVPALWQLQ。

6.按照權(quán)利要求1所述的基因工程共固定化木聚糖降解酶的制備方法，其特征在于，步驟如下：

(1)重組表達載體的構(gòu)建：

根據(jù)標簽DNA序列設(shè)計上、下游引物，所述的上游和下游引物各含有標簽結(jié)構(gòu)一半基因序列，以表達質(zhì)粒為模板進行反向PCR擴增，得到含有標簽序列的DNA擴增產(chǎn)物，通過反向磷酸化、連接、轉(zhuǎn)化，得到帶有標簽結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒；然后克隆出木聚糖降解酶基因，經(jīng)酶切后分別插至帶有標簽結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒，與親和標簽結(jié)構(gòu)基因進行融合，獲得帶有木聚糖降解酶和親和標簽結(jié)構(gòu)基因的重組質(zhì)粒；

(2)重組菌的培養(yǎng)與粗酶制備：

將帶有親和標簽的木聚糖降解酶的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主，在LB培養(yǎng)基中25～37℃溫度培養(yǎng)12-24h，然后將菌液在0-10℃、轉(zhuǎn)速4000-6000rpm條件下離心，用水洗滌沉淀物3次，再用0.02-0.5M?pH6.0-8.0的緩沖液重懸，置冰水浴中超聲破碎或用高壓破碎，破碎后的菌液在0-4℃、10000-13000rpm條件下離心10-30min，取上清，即得帶有親和標簽的木聚糖降解酶的粗酶液；

(3)共固定化木聚糖降解酶的制備：

將固定化載體幾丁質(zhì)先進行溶脹或酸解處理，將幾丁質(zhì)與粗酶按照重量比為1∶0.01-0.2溶于pH?4-9的緩沖液中，常溫下混合攪拌1h以上，離心去上清，再用緩沖液洗滌至無蛋白檢出，獲得共固定在幾丁質(zhì)上的木聚糖降解酶，即為基因工程共固定化木聚糖降解酶。

7.按照權(quán)利要求6所述的基因工程共固定化木聚糖降解酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)中將得帶有親和標簽的木聚糖降解酶的粗酶液在60-70℃溫度條件下熱處理10-20min，以去除大量菌體雜蛋白，獲得純度較高酶液。