[發(fā)明專利]一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210121654.0
• 申請日: 2012-04-24
• 公開（公告）號: CN102630646A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝珍玉;周永燦;胡超群
• 申請（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 海口翔翔專利事務(wù)有限公司 46001
• 代理人: 李勇;劉清蓮

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技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法。

背景技術(shù)

扁枝濱珊瑚（Porites?andrewsi?Vaughan）等枝狀珊瑚為熱帶海域造礁石珊瑚的主要優(yōu)勢種，這些珊瑚常存在白化等多種疾病。近年來，頻繁發(fā)生的珊瑚疾病導(dǎo)致了珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)嚴(yán)重退化，影響了全球珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的平衡，受到了人們的高度重視，國際上諸多重要學(xué)者建議盡快建立能有效確定珊瑚病原的方法。不過，由于珊瑚是一類生活在海洋環(huán)境中的開放式低等真核動物，由水螅體與單細(xì)胞蟲黃藻共生，除了光合作用外，水螅體和蟲黃藻都與外界水體進(jìn)行較直接的物質(zhì)交換，致使水體中的病原細(xì)菌等存在侵染水螅體或蟲黃藻的可能。又由于水螅體和蟲黃藻都是相對較小的個體，無法實現(xiàn)從其體內(nèi)直接分離病原，因此，無論是以健康珊瑚組織還是發(fā)病珊瑚組織為樣品，都是同時分離獲得多種不同菌落形態(tài)的細(xì)菌，難以通過基于庫克氏原則的人工感染方法來確定珊瑚疾病的細(xì)菌性病原。為此，本發(fā)明建立一種相對快速地確定珊瑚病原的鳥槍打靶式人工感染方法,?與傳統(tǒng)單一菌株人工感染方法相比，該方法具有操作簡單、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點，可作為國內(nèi)外珊瑚疾病細(xì)菌病原篩選的首選方法。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明的目的是提供一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法。

本發(fā)明是為了尋找一種簡單、方便、有效的方法來快速準(zhǔn)確地確定枝狀珊瑚的細(xì)菌病原。

首先，將從患病珊瑚分離獲得的菌株隨機分成若干個試驗組，利用這些混合菌液平行組同時對健康珊瑚進(jìn)行“二步法”海區(qū)人工感染；然后，再將誘發(fā)健康珊瑚患病的試驗組菌株分別對健康珊瑚進(jìn)行“一步法”室內(nèi)人工感染；最終，確定誘發(fā)健康珊瑚患病的細(xì)菌病原，從而實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的珊瑚細(xì)菌病原分離和鑒定過程。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

運用鳥槍打靶法確定枝狀珊瑚細(xì)菌病原所要使用的材料，包括：

（1）實驗對象：枝狀樣品珊瑚。

（2）實驗材料：1m長直徑為1.0cm的304不銹鋼鋼釬、直徑0.3cm的聚酯綁繩、塑料綁帶、研缽、24×20×36cm的無色塑料桶、超凈工作臺、移液器、tip頭、1.5ml?Eppendorf管、2ml?凍存管、2216E?海水液體培養(yǎng)基、TCBS固體培養(yǎng)基。

使用上述鳥槍打靶法確定枝狀珊瑚細(xì)菌病原包括下列步驟：

1、樣品采集、處理及病原分離、純化和擴大培養(yǎng)

在超凈工作臺中采集發(fā)病部位珊瑚組織0.5~1.0g，用研缽將其磨成粉末狀，將粉末轉(zhuǎn)入帶有1ml滅菌海水的離心管中，用移液器吹打5min，室溫靜置5?min，吸取100μl上清液涂布于固體2216E海水培養(yǎng)基或TCBS培養(yǎng)基平板。室溫培養(yǎng)24~48h，依據(jù)菌落形態(tài)的不同，挑取平板上多個不同形態(tài)的單菌落，分別接種于含1ml的液體2216E海水培養(yǎng)基的凍存管中擴大培養(yǎng)，使菌液濃度達(dá)10⁹CFU/ml。

2、菌液分組混合及珊瑚人工感染

（1）隨機將所有菌株的菌液分成多組，并按組混合后用于人工感染。

（2）在24×20×36cm的無色中裝8~10L過濾和消毒過的海水，同時放入3~5枝細(xì)菌來源相同的健康珊瑚，暫養(yǎng)3~5d，健康生長的珊瑚用于后續(xù)試驗。將每組混合菌液分別加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶對應(yīng)1組混合菌液，形成若干人工感染試驗組；在上述含有健康珊瑚的塑料桶中，加入與菌液等體積的2216E液體培養(yǎng)基，形成對照組；浸泡感染12h。

（3）珊瑚固定裝置的構(gòu)建與海區(qū)試驗：選取與樣品珊瑚生長生境相似的平坦海區(qū)，垂直于海流方向固定鋼釬，間距為8~12m；以保持珊瑚健康生長環(huán)境為原則，在兩根鋼釬間平行拉上兩條聚酯綁繩，確保綁繩的合適離地距離、合適間距，構(gòu)成珊瑚固定裝置。將試驗組和對照組珊瑚轉(zhuǎn)移到試驗海區(qū)，用塑料綁帶將所有珊瑚按組別固定于聚酯綁繩上。

3、海區(qū)感染珊瑚的觀察

在珊瑚轉(zhuǎn)入海區(qū)后，每1~2天觀察并記錄試驗結(jié)果，觀察周期為15~20天；當(dāng)對照組珊瑚正常生長而某一試驗組珊瑚出現(xiàn)與細(xì)菌分離樣品珊瑚相同病癥時，確定引發(fā)該流行病的病原菌存在于該試驗組菌株中。

4、珊瑚的室內(nèi)人工感染