[發(fā)明專利]一種人工合成的信號(hào)肽及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210118230.9
• 申請(qǐng)日: 2010-09-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102659927A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周永春;張玉晶;厲穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司;上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C12N15/11;C12N15/85;C12N5/10;C12P21/02
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本案為以下專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)：

申請(qǐng)?zhí)枺?01010284904.3；

申請(qǐng)日：2010年9月17日；

發(fā)明名稱：一種人工合成的信號(hào)肽及其應(yīng)用

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

外源基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析、蛋白質(zhì)或多肽類藥物研究開(kāi)發(fā)的先決條件。用于表達(dá)重組蛋白的表達(dá)體系有微生物、植物、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)具有天然活性蛋白的最佳宿主，其優(yōu)勢(shì)在于能正確有效地識(shí)別真核蛋白的合成、加工和分泌信號(hào)，識(shí)別和去除基因中的內(nèi)含子，再經(jīng)剪切加工成為成熟的mRNA，能準(zhǔn)確地完成糖基化、磷酸化，形成鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵及蛋白水解等翻譯后加工過(guò)程，因而產(chǎn)生的完整抗體和天然抗體一樣，具有生物學(xué)活性，既可識(shí)別抗原又可激活補(bǔ)體系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞易被重組的DNA轉(zhuǎn)染，經(jīng)過(guò)篩選可得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性，表達(dá)的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中易于純化。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白產(chǎn)物已廣泛應(yīng)用于生物制品工業(yè)，如病毒疫苗、抗體、干擾素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、和生長(zhǎng)因子等的大量制備。但動(dòng)物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率低，且成本高，因此提高動(dòng)物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率，降低生產(chǎn)成本是當(dāng)前工作中的重中之重。

影響外源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的因素很多，如信號(hào)肽、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制因子、RNA加工(RNA?Processing)、基因拷貝的數(shù)目、mRNA的穩(wěn)定性、外源基因在染色體上的整合位點(diǎn)、重組蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性和宿主細(xì)胞的基因組偏好性(genetic?properties)等。在表達(dá)載體已經(jīng)確定的情況下，信號(hào)肽的選擇就顯得至關(guān)重要了。

分泌蛋白的N-端通常由可被剪切的15-30Aa的前導(dǎo)順序組成，此順序稱為信號(hào)肽(signal?sequence)，在N-端或靠近N端處有2-3個(gè)極性Aa，而在信號(hào)肽的中部都是一個(gè)唯一的疏水核心或者由很多的疏水Aa構(gòu)成。信號(hào)肽中沒(méi)有其它保守順序也沒(méi)有酸性基團(tuán)。和導(dǎo)肽相似，信號(hào)肽也是可足以將任何附加的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)靶膜。例如將信號(hào)肽加在珠蛋白的N-端，就可使它不再留在胞液中，而是穿過(guò)膜而分泌到胞外。

信號(hào)肽可使正在翻譯的核糖體附著到RER膜上。核糖體是通過(guò)信號(hào)肽的功能而附著并合成分泌蛋白的。因此游離的核糖體和膜結(jié)合核糖體之間本身并無(wú)差異。信號(hào)肽是作為一種附著到ER膜上的信號(hào)識(shí)別，此可能通過(guò)開(kāi)始合成出的N-端頭幾個(gè)氨基酸的疏水功能。然后蛋白鏈插進(jìn)膜中，信號(hào)肽埋在膜中的一種蛋白酶所剪切這時(shí)核糖體已完成翻譯，蛋白已延著導(dǎo)肽途經(jīng)穿過(guò)膜。信號(hào)肽分泌外源蛋白的作用如下：

1)信號(hào)肽能夠引導(dǎo)分泌蛋白或膜蛋白出胞。

2)信號(hào)肽的疏水核心決定蛋白質(zhì)的分泌效率。

3)信號(hào)肽能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域或不同細(xì)胞器進(jìn)行正確的定位。

4)信號(hào)肽能夠分泌增強(qiáng)子增強(qiáng)外源蛋白的分泌。

5)短的信號(hào)欣有利于減少表達(dá)載體的分子置，提高整合到宿主染色體上外源基因表達(dá)盒的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。

對(duì)于分泌蛋白，選擇合適的信號(hào)肽可以將其表達(dá)量成倍提高，無(wú)論對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)還是科學(xué)研究，其意義都是非常深遠(yuǎn)的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種可以引導(dǎo)外源哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白高效表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用，以降低哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的生產(chǎn)成本。

首先，本發(fā)明提供了一種人工合成的用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽的氨基酸序列選自SEQ?ID?NO：1-5中的任一。其中，SEQ?ID?NO：1-5的信號(hào)肽具有較高的同源性。

SEQ?ID?NO：1??MDVLAFLLGLLLLWLPGVRC

SEQ?ID?NO：2??MDVPAEFLGLLLLWLSGVRC

SEQ?ID?NO：3??MRVLPEFLGLLLLWISGVRC

SEQ?ID?NO：4??MDVPLQLLGLLLLWLSGVRC

SEQ?ID?NO：5??MDVPAELLGLLLLWISGVRC

所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是CHO、BHK、SP2/0、C127等。

本發(fā)明的信號(hào)肽可用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的分泌表達(dá)。