[發明專利]一種用于測定GLP-1及其功能類似物生物活性的細胞株及其應用

無效

• 申請號: 201210117317.4
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN102649947A
• 公開（公告）日: 2012-08-29
• 發明（設計）人: 楊建良;王軍志;饒春明;陸晶;王蘭
• 申請（專利權）人: 無錫和邦生物科技有限公司;中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種表達胰高血糖素樣肽-1受體蛋白的基因工程細胞株的建立，以及基于此細胞株受到胰高血糖素樣肽-1及其功能類似物刺激后cAMP水平的變化來測定胰高血糖素樣肽-1及其功能類似物生物活性的檢測方法，屬于藥物生物活性檢測技術領域。

背景技術

胰高血糖素樣肽-1（Glucogan?like?Peptide-1,?GLP-1）作用于胰島β細胞胰高血糖素樣肽-1受體（Glucogan?like?Peptide-1?Receptor，GLP-1R），促進胰島素基因的轉錄、胰島素的合成和分泌，并可刺激胰島β細胞的增殖和分化，抑制胰島β細胞凋亡，增加胰島β細胞數量。研究證明，GLP-1可通過多種機制明顯地改善2型糖尿病動物模型或患者的血糖情況，這為2型糖尿病的治療提供了一個非常好的前景。

促胰島素分泌肽（Exendin-4）是從生長在美國西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥（Gila?monster）唾液發現的一種多肽物質，氨基酸序列的53%與人類血液中調控血糖的GLP-1同源。Exendin-4同樣是GLP-1R激動劑，與GLP-1功能相似，具有促進胰腺分泌胰島素，促進機體對血糖的利用、減少肝糖原分解、通過減緩胃腸道的蠕動使食物的吸收減慢，從而降低食物中的葡萄糖在血液內出現的高峰，達到降低血糖作用。此外，它還有通過作用于中樞神經系統控制食欲等多種生理功能。由于Exendin-4不被二肽基肽酶－IV降解，其穩定性明顯高于GLP-1。由美國Lilly公司和Amylin公司研制的Exendin-4(Byetta^??)，2005年獲得了美國FDA批準用于治療2型糖尿病全新類型的藥物。在生理條件下，Byetta^?和GLP-1作用相似，它刺激胰島素分泌的作用受血糖濃度的調節，血糖濃度降低時其刺激作用減輕或消失，因而不會出現胰島素持續分泌而發生低血糖的現象，并有明顯減少2型糖尿病肥胖患者體重的作用。然而，Exendin-4在人體內的半衰期為數小時，患者還是需要每天注射Byetta^?兩次，使用上仍然相當不方便。目前正在研究具有長效治療效果的GLP-1、Exendin-4藥物。治療糖尿病的長效蛋白質藥物在保持降糖活性的同時可以延長藥物在體內的半衰期，不僅可以減少注射頻率，方便患者使用，同時還可達到降低治療費用之目的。

建立有效的GLP-1及其功能類似物生物活性的測定方法，是評價新藥藥效的關鍵措施之一。目前，國內GLP-1及其功能類似物活性檢測依然依賴于傳統的動物測定方法。其檢測方法存在實驗動物不易獲得，操作復雜，數據重復性差，檢測方法難于標準化等缺點。本發明采用基因工程技術，構建了一個能穩定表達GLP-1R的基因工程人胚腎HEK293細胞株（GLP-1R/HEK293），建立了基于檢測GLP-1R/HEK293細胞株在受到外來刺激后細胞中環磷酸腺苷（Cyclic?Adenosine?monophosphate，cAMP）含量的變化來測定外來刺激中GLP-1、Exendin-4及其功能類似物生物活性的檢測方法，檢測方法易標準化，重復性好，具有成本低、方便、準確的特點，因而具有良好的應用前景。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于在體外測定GLP-1及其功能類似物生物活性的基因工程細胞株GLP-1R/HEK293。GLP-1R/HEK293細胞株的工作原理是：GLP-1R/HEK293細胞株能在細胞膜上穩定表達GLP-1R蛋白，該受體蛋白受到GLP-1及其功能類似物的作用時，GLP-1R/HEK293細胞內的cAMP含量會迅速升高，cAMP升高的水平與刺激物中GLP-1及其類似物的生物活性呈正相關。通過與GLP-1標準品生物活性的比較，測定未知樣品中的GLP-1及其類似物的生物活性。

為構建能穩定表達GLP-1R的HEK293細胞株，本發明是通過以下技術方案來實現。

本發明的技術方案：一株GLP-1R/HEK293細胞株，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC?No.5909，用胰高血糖素樣肽-1受體，簡寫為GLP-1R，轉染人胚腎HEK293細胞，獲得的一株GLP-1R/HEK293細胞株。

所述GLP-1R/HEK293細胞株的應用，轉染了GLP-1R基因條件下，在受體激動劑刺激下能誘導GLP-1R/HEK?293細胞胞內第二信使cAMP含量增加，轉染的GLP-1R基因能夠穩定表達；