[發明專利]一種南方紅豆杉腋芽離體誘導培養生產紫杉醇的方法

無效

• 申請號: 201210116727.7
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN102630566A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 杜亞填;張翔宇;龔雪原
• 申請（專利權）人: 吉首大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 張家界市慧誠商標專利事務所 43209
• 代理人: 高紅旺

技術領域

本發明涉及生物領域，具體的說，一種南方紅豆杉腋芽離體誘導培養生產紫杉醇的方法。

背景技術

紅豆杉，是世界上公認的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，是第四紀冰川遺留下來的古老樹種，已有250萬年的歷史。紅豆杉屬植物分布在北半球,為高大喬木,種群分布稀少，生長速度緩慢，再生能力差，所以很長時間以來，世界范圍內還沒有形成大規摸的紅豆杉原料林基地。我國已將其列為一級珍稀瀕危保護植物，聯合國也明令禁止采伐。紅豆杉屬植物在全世界共有十一種，南方紅豆杉(Taxus?chinensis?var.?mairei)是紅豆杉在中國的一個變種。

Amos等（1981）發現在WPM培養基中加入低濃度6-BA有利于芽產生；高濃度6-BA則抑制芽伸長生長。Barnes（1983）發現在含1mg/LBA的WPM?培養基上，加拿大紅豆杉的莖尖腋芽生長較好。Chee（1995）在短葉紅豆杉離體胚誘導不定芽的研究中，將其接種在1/2B5+10μM6-BA培養基上，14d后離體胚上誘導出了芽原基。楊振國等（1997）利用東北紅豆杉幼枝頂芽作外植體，以MS為基本培養基，誘導出了叢生芽。程廣有等（1997）發現6-BA/IBA比值與東北紅豆杉莖尖誘導側芽的生長量和愈傷組織生長量有很大關系，比值大時可產生不定芽。浩仁塔本等（2004）研究發現，東北紅豆杉莖尖的芽分化與生長對不同質量濃度的激素不太敏感，6-BA比較有利于芽的分化，而KT有利于愈傷組織的產生。馬均等（2007）以曼地亞紅豆杉帶芽莖段為外植體，在MS+0.05?mg/L6-BA+0.5?mg/LNAA培養基中的啟動率最高，達到了89.55%，且發現低濃度的6-BA更有利于芽的啟動。唐道方等（2008）采用南方紅豆杉帶芽莖段為外植體，研究南方紅豆杉組織培養芽增殖和植株再生的條件，結果表明：春季生長旺盛期的嫩枝最適合腋芽增殖誘導培養，其最佳培養基為DCR+0.1mg/L?IBA+0.05mg/L6-BA。張圣喜等（2010）研究發現DCR+?0.5?mg/L6-BA+0.8?mg/LNAA也比較適合南方紅豆杉外植體直接誘導出芽。但應用TIBA進行紅豆杉屬植物腋芽增殖誘導方面還未見有報道。

經對現有技術文獻的檢索發現，專利申請號：CN200610000193.6，公開號：CN100999719，發明名稱：北美紅杉葉片不定芽和體細胞胚胎的誘導與植株再生方法，該方法是以北美紅杉莖尖為外植體，在?BA?0.5mg/L+KT?0.2mg/L+IBA?0.2mg/L和?BA0.5mg/L+IBA?0.5mg/L的SH培養基上誘導出了不定芽和體細胞胚胎。該方法為所用之培養基與本技術所用之培養基配方完全不同，該技術可實現北美紅杉苗木的大規模、短周期、高繁殖率、低成本的工廠化生產,并對于揭示細胞分化、發育、形態發生及合子胚產生的機制具有重要意義。專利申請號：CN200610136929.2，公開號：CN101209028，發明名稱：紅豆杉電磁脈沖快繁及產業化種植方法，該方法采用計算機環境控制技術和電磁脈沖技術與開放式快速繁育技術相結合,利用植物的“全能性”和“全息性”,運用對植物生長環境因子專家分析系統功能,自適應調節苗床的溫度、濕度、氧氣、二氧化碳氣體濃度、養分等植物繁育條件,為不同植物的離體材料創造最適合生根壯苗的環境條件,實現植物以苗繁苗的快速增殖,在較短時間內得到工廠化大批量優質的紅豆杉栽種苗。雖然這些方法均對紅豆杉快繁有較好的效果，但是均沒有提及到采用TIBA誘導南方紅豆杉腋芽增殖。且以上技術均以紅豆杉大量快繁為培養目的，而本發明還在于通過試管微芽誘導培養生產抗癌藥物紫杉醇。

發明內容

本發明的目的是提供一種在離體條件下通過南方紅豆杉腋芽誘導培養生產紫杉醇的方法，為以南方紅豆杉為原材料生產紫杉醇提供一種新的路徑。

為實現本發明目的，本發明所采用的技術方案為：一種在離體條件下誘導南方紅豆杉腋芽萌發然后進行培養生產提取紫杉醇的方法，包括以下步驟:?

（1）從南方紅豆杉樹木上剪取當年生嫩梢，摘除葉片，剪切成2～3?cm長的小莖段；

（2）燒杯中加水，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，攪拌均勻，然后將剪切好的小莖段放入燒杯攪拌清洗30min，取出后用自來水沖洗2h，然后轉入無菌超凈工作臺，用70～75%的酒精浸泡消毒30s，無菌水清洗4次，再用0.1～0.25%的HgCl₂溶液浸泡消毒8min，無菌水清洗6次，于超凈工作臺內晾干表面水后備接種用；