[發明專利]一種草魚出血病口服疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 201210116061.5
• 申請日: 2012-04-19
• 公開（公告）號: CN102614509A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 貢成良;薛仁宇;曹廣力;陳輝;劉林;徐詩英;鄒勇
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: A61K39/15
• 分類號: A61K39/15;A61P31/14;C12N15/46;C12N7/01;C12N15/866
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒

1.一種草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于，包括下列步驟：

(1)?通過基因工程方法制備帶有草魚出血病病毒結構蛋白VP6基因的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6；

(2)?將重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6感染家蠶培養細胞BmN進行擴增，采用擴增后的重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6接種至五齡家蠶幼蟲或蛹；

(3)?收集接種病毒4～6天后的五齡家蠶幼蟲或蛹，采用冷凍干燥法制備獲得凍干粉；

(4)將步驟(3)獲得的凍干粉與粉狀魚飼料均勻混合，即獲得草魚出血病口服疫苗，按重量計所述凍干粉在草魚出血病口服疫苗中的含量為1～10%。

2.根據權利要求1所述的草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)具體包括以下步驟：

①根據GenBank已公開的草魚出血病病毒結構蛋白VP6的cDNA編碼序列，合成5’端和3’端分別帶EcoRI和HindⅢ位點的VP6基因的編碼序列，克隆進T-載體，獲pMD19T-VP6質粒；

②用EcoRI/HindⅢ雙酶切消化pMD19T-VP6質粒，回收VP6基因片段，用EcoRI/HindⅢ雙酶切消化供體質粒pFastBac-Dual，回收pFastBac-Dual片段，將VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和HindⅢ之間，將VP6基因克隆進pFastBac-Dual載體中的桿狀病毒多角體基因啟動子下游獲得pFastBac-ph-VP6重組質粒；

③以pMD19T-VP6質粒為模板，PCR合成5’端和3’端分別帶XhoI和KpnI位點的VP6基因的編碼序列，XhoI/KpnI?雙酶切后克隆進用XhoI/KpnI雙酶切的?pFastBac-ph-VP6中獲?pFastBac-VP6-ph-VP6；

④根據GenBank已公開的團頭魴Megalobrama?amblycephala的?β-肌動蛋白啟動子序列合成5’端和3’端分別帶SmaI和XhoI位點的β-肌動蛋白啟動子序列，克隆進T-載體，獲pMD19T-β-actin質粒；

⑤用SmaI/XhoI雙酶切pMD19T-β-actin質粒，回收β-肌動蛋白啟動子序列片段，SmaI/XhoI雙酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，將β-肌動蛋白啟動子序列片段插入到pFastBac-VP6-ph-VP6的SmaI和XhoI之間，獲得pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重組質粒；

⑥將pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重組質粒轉化大腸桿菌BmDH10Bac感受態細胞，涂布于含四環素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG和X-gal的LB?瓊脂培養平板上，37℃培養1～2天，挑取白色菌落培養，提取重組Bacmid?基因組Bacmid-IIVP6?DNA；

⑦將Bacmid-IIVP6?DNA由脂質體介導轉染家蠶培養細胞BmN，培養細胞后取上清，獲得重組桿狀病毒BmNPV-IIVP6。

3.根據權利要求1所述的草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)中凍干粉的制作方法是，取收集的五齡家蠶幼蟲或蛹，冰浴勻漿，加入3～5倍重量的生理鹽水，混勻，過濾，濾液冷凍干燥至水份含量小于2wt%，粉碎過篩，獲得凍干粉。

4.根據權利要求3所述的草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于：在接種病毒4～6天后收集五齡家蠶幼蟲或蛹。

5.根據權利要求1所述的草魚出血病口服疫苗的制備方法，其特征在于：按重量計所述凍干粉在草魚出血病口服疫苗中的含量為1～10%。