[發(fā)明專利]一種基于熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶檢測基因突變和SNP位點的試劑盒及方法

有效

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• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN102660641A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設計）人: 陳唯軍;趙金銀;謝飛飛;劉淇;徐磊;李雪
• 申請（專利權(quán)）人: 北京宏微特斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京金信立方知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 朱梅;徐琳

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種基于熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶檢測基因突變和SNP位點的試劑盒和方法。

背景技術

個體化醫(yī)療，就是針對病人的特征，因病因人用藥，使病人在獲得最大利益的同時使毒副作用減少到最輕。目前，基因突變(點突變、缺失突變、插入突變)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)在個體化醫(yī)療中引起廣泛關注。

肺癌是嚴重危害人民生命和健康的常見病。研究表明表皮生長因子受體(EGFR)基因突變與肺癌病人對抗腫瘤藥物易瑞莎的敏感性有關，其中以19號外顯子內(nèi)缺失突變以及21號外顯子的點突變L858R最為常見。但當用藥一段時間后，EGFR基因會發(fā)生二次突變，導致耐藥產(chǎn)生。EGFR基因耐藥主要突變型為Thr790位點的Thr790Met突變，發(fā)生C＞T突變。此外，若肺癌患者存在K-ras原發(fā)性基因突變，即使存在EGFR基因敏感性突變，對易瑞莎等靶向藥物也會產(chǎn)生耐藥。主要突變型為Gly12位點的Gly12Arg、Gly12Cys、Gly12Ser、Gly12Ala、Gly12Asp、Gly12Val，Gly13位點的Gly13Asp、Gly13Val。因此，在對肺癌患者選擇進行靶向藥物治療或?qū)τ盟幏伟┗颊哌M行用藥監(jiān)控時，需對EGFR基因Thr790Met突變和K-ras基因的主要突變型進行檢測，以確認是否用藥有效。

此外，K-ras基因突變與大腸癌等腫瘤患者酪氨酸激酶抑制劑等靶向藥物的原發(fā)性耐藥有關。K-ras基因突變檢測做為結(jié)直腸癌患者進入個體化靶向治療療程之前需要進行的檢測，已經(jīng)被NCCN(美國癌癥綜合網(wǎng)絡)列為《結(jié)腸癌臨床治療指南》中必不可少的一項。K-ras基因野生型的患者能從愛必妥(Erbitux，又稱西妥昔單抗/Cetuximab)或維克替比(Vectibix，又稱帕尼單抗/Panitumumab)治療中獲益，而K-ras基因突變的大腸癌患者治療效果較差。美國FDA和歐洲藥監(jiān)局明確規(guī)定了在使用靶向藥物愛必妥和維克替比治療轉(zhuǎn)移性大腸癌前必須檢測K-ras基因。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是人類基因組中最常見的遺傳多態(tài)性表達形式，SNP在基因組中分布相當廣泛，在人類基因組中每300-1000堿基對就出現(xiàn)一次，SNP總量大概是3×10⁶個。近年的研究表明，SNP位點與個體表型差異、對藥物或疾病的易感性相關。因此，SNP位點的研究已廣泛用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關基因的鑒定、藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究中等。

SNP位點的檢測，在個體化醫(yī)療中也具有廣泛的應用前景和價值。例如，核苷酸切除修復(NER)和堿基切除修復(BER)是人體內(nèi)兩種極為重要的DNA修復途徑，XRCC1和ERCC1基因分別在NER和BER途徑中發(fā)揮重要作用。XRCC1中Arg399Gln(CAG→CGG)多態(tài)性位于蛋白質(zhì)重要的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，ERCC1中Asn118Asn多態(tài)性(對應于AAC和AAT的無義突變)能夠影響到ERCC1蛋白的表達水平，這兩個基因的多態(tài)性影響到腫瘤細胞對鉑類化療藥物的敏感性。有研究表明XRCC1基因中399位GG基因型患者采用鉑類藥物的療效更佳，而ERCC1基因中118位密碼子CC基因型對鉑類藥物化療反應性較好。因此，可通過對SNP位點的檢測實現(xiàn)個體化用藥指導。

目前，DNA測序法仍然是檢測SNP位點和基因突變使用最多的方法，但需要獲取組織、分離細胞、提取核酸和進行測序，所需時間長、費用高，對取材和技術要求都比較嚴格，因此應用于臨床仍受到一定程度的限制。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題，本發(fā)明將熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶與Taq酶融合在一個反應體系中，通過在實時熒光定量PCR中對野生型基因進行實時酶切，從而實現(xiàn)對突變基因和SNP位點的檢測，為臨床提供一種簡便、快速、準確和經(jīng)濟的SNP位點和基因突變分析方法。

因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種檢測基因突變(包括點突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點的試劑盒。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測基因突變(包括點突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點的方法，利用該方法可以提高檢測基因突變的分辨率。

根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供一種檢測基因突變(包括點突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點的試劑盒，其中，所述試劑盒包含酶切野生型基因的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶。本發(fā)明中，所述試劑盒包含擴增引物，優(yōu)選地，在所述擴增引物中通過錯配堿基的方式引入所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶的酶切位點，從而使所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶在PCR反應的同時酶切野生型PCR產(chǎn)物。