[發明專利]功能性結核分枝桿菌抗原多肽及其應用

有效

• 申請號: 201210115086.3
• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN102653554A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 于楊;劉海鷹;張艷;金奇
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院病原生物學研究所
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C12N15/31;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/078;A61K39/04;A61K48/00;A61P31/06
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及功能性結核分枝桿菌抗原多肽及其應用。

背景技術

據WHO統計，世界上近1/3的人口感染有結核分枝桿菌(M.tb)，且隨著耐藥結核病和結核病與艾滋病混合感染患者的增多，結核病已經嚴重危害人民健康，據統計近幾年在我國傳染病發病數和死亡數中肺結核的排名一直位居前兩位。結核病已是一種嚴重危害人民健康和國民經濟的傳染病，而中國是結核病的高負擔國，那么對于結核病防控策略的制定就成為了關系我國國計民生的重大問題。結核病的治療目前應用最多的當屬“化療”，化學藥物的治療對結核病有明顯的效果，但隨著“耐多藥結核”(MDR-TB)和“嚴重耐藥結核”(XDR-TB)發病率的升高，化療顯現出了局限性。那么，新的防治方法就成為了亟待解決的問題。一直以來，利用免疫學方法尋找新的有效預防和治療結核病的手段都是該領域研究的熱點與重點。運用疫苗預防和治療結核病是最有效的結核病防控策略之一，但是現階段研究進展緩慢。目前，唯一可用于預防結核病的疫苗——卡介苗(BCG)僅對兒童播散性結核有一定的保護效果，但一般認為對成人結核保護效果比較弱。雖然一些新型的抗結核病疫苗相繼被開發，但大多仍處于探索階段，效果不甚理想。其中重要原因除了結核病免疫保護機理不清楚，就是在不同感染時期引起免疫保護反應的結核分枝桿菌有效抗原仍然不明確，這就成為了疫苗設計以及免疫策略制定的障礙。抗原關系到疫苗的成敗，那么篩選出與發病密切相關的功能性抗原以及更好地了解其免疫應答機制就可以為研制不同臨床需求的疫苗、制定免疫策略提供更多實際應用選擇。

在腫瘤研究領域有研究表明，利用含有Hsp70、Gp96(腫瘤細胞表達的分子伴侶蛋白)等蛋白的疫苗免疫小鼠后可引起針對腫瘤抗原的特異性免疫反應，推測分子伴侶攜帶有腫瘤特異性抗原肽；在感染性疾病研究領域，有研究從乙肝病灶組織中提取的Gp96蛋白帶有一段HBV特異性抗原。對于肺結核病研究領域，目前還沒有直接從肺組織內篩選結核桿菌抗原的相關報道。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種具有促進淋巴細胞增殖功能的多肽。

本發明所提供的多肽，名稱為Pep1，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

其中，序列表中的序列1由16個氨基酸殘基組成。

編碼Pep1的基因、以及含有該基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發明的保護范圍。

Pep1是本發明的發明人將Rotofor技術整合液相質譜聯用技術，直接從病人病變肺組織篩選出的結核分枝桿菌抗原多肽。實驗證明，Pep1可以特異性刺激H37Rv感染小鼠脾臟淋巴細胞和淋巴結淋巴細胞顯著增殖，可以用于制備淋巴細胞增殖劑和研制結核病疫苗。

附圖說明

圖1為Pep1和Pep2刺激小鼠脾臟和淋巴結細胞增殖實驗結果。

右上圖為小鼠脾臟細胞增殖實驗。

右下圖為小鼠淋巴結細胞增殖實驗。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1、功能性結核分枝桿菌抗原多肽刺激小鼠脾臟和淋巴結細胞增殖

本實施例采用的功能性結核分枝桿菌抗原多肽是Pep1(fadB5-1)和Pep2(fadB5-2)，Pep1的氨基酸序列如序列表中序列1所示；Pep2的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

1、Pep1和Pep2的制備

Pep1和Pep2采用固相多肽合成法(Fmoc法)由羧基端向氨基端方向合成。其中，所采用的樹脂是取代度為0.5的2-CL-Trt。合成的多肽采用高效液相色譜進行純化得到純度為98％的Pep1和Pep2。純化的Pep1和Pep2經質譜鑒定，Pep1的氨基酸序列如序列表中序列1所示；Pep2的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2、刺激小鼠脾臟和淋巴結細胞增殖實驗

實驗流程如圖1所示，包括以下步驟：

2.1結核分枝桿菌H37Rv感染小鼠模型的制備