[發明專利]蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法

有效

• 申請號: 201210114817.2
• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN102643791A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 顧軍;洪岸;陳小佳
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12R1/84
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)將表達蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的畢赤酵母發酵液離心，收集上清，用緩沖液A對上清透析；

(2)通過依次連接的強陽離子瓊脂糖凝膠層析柱和強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱對步驟(1)得到的透析后的上清進行聯合層析，首先用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，接著用含有0.1M?NaCl的緩沖液A對強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱洗脫，得到含有目的蛋白的洗脫液；

(3)將含有目的蛋白的洗脫液進行苯甲脒瓊脂糖凝膠層析，首先用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，接著采用緩沖液B進行非特異蛋白洗脫，直至280nm吸收值是0并保持穩定；最后更換緩沖液C進行洗脫，收集緩沖液C洗脫的蛋白樣品；

(4)將步驟(3)收集的緩沖液C洗脫的蛋白樣品滴入緩沖液D，使pH值調回7.8～8.2；

(5)用緩沖液E對步驟(4)最終得到的溶液透析，凍干，得到蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin；

所述的緩沖液A為pH?7.8～8.2、15～25mM?Tris溶液；所述的緩沖液B為含有0.95～1.05MNaCl的pH?7.8～8.2、15～25mM?Tris溶液；所述的緩沖液C為pH?3.1～3.3、45～55mM的甘氨酸溶液；所述的緩沖液D為pH?7.8～8.2、0.95～1.05M?Tris溶液；所述的緩沖液E為pH?7.8～8.2、15～25mM?Tris溶液。

2.根據權利要求1所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于：所述的緩沖液A為pH?8.0、20mM?Tris溶液；所述的緩沖液B為含有1MNaCl的pH?8.0、20mM?Tris溶液；所述的緩沖液C為pH?3.2、50mM的甘氨酸溶液；所述的緩沖液D為pH?8.0、1M的Tris溶液；所述的緩沖液E為pH?8.0、20mM?Tris溶液。

3.根據權利要求1所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于：步驟(1)中所述的離心的條件為4～8℃、10000～12000rpm、離心30～40min。

4.根據權利要求1所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于：步驟(1)中所述的透析的時間為24～30小時。

5.根據權利要求1所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于：步驟(2)中所述的聯合層析的條件為：過柱流速為1～2mL/min，最高柱壓小于0.40Mpa。

6.根據權利要求1所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于：步驟(3)中所述的苯甲脒瓊脂糖凝膠層析的條件為：過柱流速為1～2mL/min，最高柱壓小于0.40Mpa。

7.根據權利要求1所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于：步驟(5)中所述的透析的時間為24～30小時。