[發明專利]重組修飾的纖溶酶

有效

• 申請號: 201210114289.0
• 申請日: 2005-04-21
• 公開（公告）號: CN102660564A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: J·A·亨特;V·諾沃哈特尼
• 申請（專利權）人: 泰勒克里斯生物治療學公司
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/68;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

發明背景

人纖溶酶原是包含791個氨基酸殘基的單鏈蛋白。通過對酶原中Arg561-Val562肽鍵的單一的裂解，導致纖溶酶原激活成為纖溶酶。所得到的纖溶酶分子是雙鏈的二硫鍵連接的絲氨酸蛋白酶，具有胰蛋白酶樣特異性(在Lys和Arg之后裂解)。

纖溶酶的氨基-末端重鏈(殘基1-561，大約60kDa)由五個三環域(kringle)組成，各自包含大約80個氨基酸殘基。所述三環域負責纖溶酶原的調控特性，如與激活抑制劑例如Cl^-1離子的相互作用；與激活刺激劑例如ε-氨基己酸的相互作用；與哺乳動物和細菌細胞的相互作用；和與其他蛋白的相互作用，如纖溶酶生理學底物血纖蛋白和纖溶酶抑制劑α2-抗纖溶酶。在所有五個三環域中，三環域1是最多功能的一種；業已證實了它的賴氨酸-結合活性負責引起纖溶酶與α₂-抗纖溶酶和血纖蛋白的相互作用。參見Wiman，B.，et?al.，Biochim.Biophys.Acta579：142-154(1979)；和Lucas，M.A.，et?al.，J.Biol.Chem.258：4249-4256(1983)。

纖溶酶的C-末端輕鏈(殘基562-791，大約25kDa)是典型的絲氨酸蛋白酶，與胰蛋白酶同源，并且包含典型的絲氨酸蛋白酶催化三聯體：His603，Asp646和Ser741。纖溶酶原包含24個二硫鍵和在Asn289和Thr346上的2個糖基化位點。

業已證實彈性蛋白酶對纖溶酶原的有限的蛋白水解產生三個片段(Sottrup-Jensen，L.，et?al.，Prog.Chem.Fibrinol.Thrombol.，3：191-209(1978))。第一個片段，K1-3，包括前三個三環域，并且能夠以兩種形式分離，Tyr79-Val338和Tyr79-Val354。第二個片段K4相當于第四個三環域，并且包括殘基Val355-Ala440。最后一個是C-末端片段(所謂的小-纖溶酶原)，包括殘基Val443-Asn791，并且由第五個三環域和絲氨酸蛋白酶結構域組成。小-纖溶酶原能夠以與纖溶酶原相同的方式被激活，形成小-纖溶酶。

由于全長纖溶酶原分子的復雜結構，細菌表達系統未證實可用于纖溶酶原的重組生產。纖溶酶原是以不溶性的內含體形式生產的，并且不能夠從那種狀態再折疊。另外，纖溶酶原在哺乳動物細胞中的表達由于纖溶酶原在細胞內激活形成纖溶酶和所致的細胞毒性而復雜化。用昆蟲細胞生產具有完全活性的纖溶酶原是可能的，不過，由于產量低該系統不適合大規模生產。

因此，需要修飾過的重組蛋白，它具備纖溶酶/纖溶酶原的理想特征，同時缺乏某些負面特征，并且能夠以較大數量在細菌細胞中生產。

發明概述

本發明提供了包含編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽具有與天然人纖溶酶原的三環域同源的單一的N-末端三環域；和與人纖溶酶原中的相應結構域同源的C-末端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域；其中，所述多肽能結合固定化的賴氨酸。所述N-末端三環域可與天然人纖溶酶原的三環域1或三環域4同源。

在某些實施方案中，所述編碼的多肽與SEQ?ID?NO：2所示出的序列的同一性為至少90％，95％，或98％。另外，所述編碼的多肽可以是SEQ?ID?NO：2所示出的序列。

所述多核苷酸的核苷酸序列可以是SEQ?ID?NO：1所示出的序列或其簡并變體。所述核苷酸序列可以編碼一種多肽，其具有與天然人纖溶酶原的三環域1或三環域4結構域同源的N-末端三環域；和與人纖溶酶原中的相應結構域同源的C-末端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域。所述核苷酸序列還可以編碼這樣的多肽，其具有單一的N-末端三環域，它與天然人纖溶酶原的三環域1或三環域4結構域至少90％相同；和與人纖溶酶原的激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域的同一性為至少90％的C-末端結構域。所述編碼的多肽能夠結合固定化的賴氨酸。

另一方面，本發明提供了多肽，其具有N-末端三環域，與天然人纖溶酶原的三環域同源；和與人纖溶酶原中的相應結構域同源的C-末端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域。

在某些實施方案中，所述多肽可具有與天然人纖溶酶原的三環域1或三環域4同源的N-末端三環域。