[發明專利]一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法

有效

• 申請號: 201210114089.5
• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN102643782A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 高旭
• 申請（專利權）人: 高旭
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，包括如下步驟：

使用羥乙基淀粉和泛影葡胺使用羥乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓樹突狀細胞分離液；

使用碳酸鈉、碳酸氫鈉和CD123抗體使用碳酸鈉、碳酸氫鈉和CD123抗體制備人血及骨髓樹突狀細胞培養瓶；

使用L-脯氨酸、胰島素、維生素C、L-谷氨酰胺、人臍帶血漿、重組人纖維母細胞生長因子和DMEM/F12基礎培養基配制人血及骨髓樹突狀細胞培養液；

分離、純化和培養人血及骨髓樹突狀細胞。

2.根據權利要求1所述的一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，使用羥乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓樹突狀細胞分離液的具體步驟為：

稱取羥乙基淀粉加熱溶解于蒸餾水中，以雙蒸水定容，制成質量分數為40％的羥乙基淀粉550料液，備用；

稱取泛影葡胺溶于雙蒸水中，用氫氧化鈉溶液調整pH至pH＝7.5～pH＝8.0，制成質量分數為60％的泛影葡胺料液，備用；

取質量分數為60％的泛影葡胺料液，加入蒸餾水制成質量分數為34％的泛影葡胺溶液，取質量分數為40％的羥乙基淀粉550料液加入蒸餾水制成質量分數為9％的羥乙基淀粉550溶液，將質量分數為34％的泛影葡胺溶液和質量分數為9％的羥乙基淀粉550溶液混和均勻并將其降溫至20℃；

用質量分數為60％的泛影葡胺料液調整質量分數為34％的泛影葡胺溶液和質量分數為9％的羥乙基淀粉550溶液的混合液，使其在20℃下比重為1.065-1.077g/ml，即為人血及骨髓樹突狀細胞分離液粗制品；

用G3漏斗、含100nm親水性濾芯的親水性微孔濾器裝置以及隔膜真空泵以≤0.06MPa的負壓過濾人血及骨髓樹突狀細胞分離液粗制品，將濾液于百級工作臺內灌裝于棕色玻璃瓶中，120℃高壓滅菌20分鐘，即為人血及骨髓樹突狀細胞分離液成品；

常溫避光保存。

3.根據權利要求2所述的一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，羥乙基淀粉的平均分子量為550萬。

4.根據權利要求3所述的一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，氫氧化鈉溶液的質量分數為10％。

5.根據權利要求2所述的一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，使用碳酸鈉、碳酸氫鈉和CD123抗體制備人血及骨髓樹突狀細胞培養瓶的具體步驟為：

稱取碳酸鈉、碳酸氫鈉于燒杯中并加雙蒸水溶解，制成0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，備用；

稱取CD123抗體，加制成的0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，制成濃度為10μg/ml的CD123抗體包被液；

向人血及骨髓樹突狀細胞培養瓶中加入濃度為10μg/ml的CD123抗體包被液，于37℃溫箱中包被處理4小時，制成人血及骨髓樹突狀細胞培養瓶。

6.根據權利要求5所述的一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，人血及骨髓樹突狀細胞培養瓶為聚苯乙烯培養瓶。

7.根據權利要求6所述的一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，使用L-脯氨酸、胰島素、維生素C、L-谷氨酰胺、人臍帶血漿、重組人纖維母細胞生長因子和DMEM/F12基礎培養基配制人血及骨髓樹突狀細胞培養液的具體步驟為：用DMEM/F12基礎培養基將500mgL-脯氨酸、200mg胰島素、50mg維生素C、100mgL-谷氨酰胺、體積百分比為10-20％的人臍帶血漿和2μg重組人纖維母細胞生長因子定容至1L。

8.根據權利要求7所述的一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，分離、純化和培養人血及骨髓樹突狀細胞的具體步驟為：

向玻璃離心管中加入2ml人血及骨髓樹突狀細胞分離液，取人外周血、骨髓或臍帶血2ml疊加于人血及骨髓樹突狀細胞分離液之液面上，形成上下兩層液體；

用水平轉子醫用離心機以離心力400g離心20分鐘，使所述上下兩層液體之間出現一層白色環狀細胞層，吸取白色環狀細胞層加于人血及骨髓樹突狀細胞培養瓶中，于37℃溫箱中靜置反應1-2小時；

反應完成后，棄去懸浮的細胞，加入人血及骨髓樹突狀細胞培養液，置于CO₂培養箱中進行培養至顯微鏡下觀察細胞鋪滿瓶底。

9.根據權利要求8所述的一種人血及骨髓樹突狀細胞分離、純化及培養的方法，其特征在于，使用碳酸鈉、碳酸氫鈉和CD123抗體制備人血及骨髓樹突狀細胞培養瓶以及分離、純化和培養人血及骨髓樹突狀細胞均在20℃無菌凈化環境下進行。