[發(fā)明專利]利用生物發(fā)酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210112625.8
• 申請(qǐng)日: 2012-04-17
• 公開（公告）號(hào): CN102618601A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏遠(yuǎn)安;姚評(píng)佳;梁錦添;黃廣君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/18
• 分類號(hào): C12P19/18;C12P19/12
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 翁建華

1.一種利用生物發(fā)酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是工藝步驟為：

(1)對(duì)巨大芽胞桿菌Bacillus?megaterium?NCIM?2087發(fā)酵葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基加以改進(jìn)，增加培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，并添加乙酸鈉和氯化鈷等成分；

(2)對(duì)枯草桿菌Bacillus?subtilis?CGMCC?1.1467進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，提取特異性果糖基轉(zhuǎn)移酶EC?2.4.1.162，并制成固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶；

(3)將炭黑曲霉Aspergillus?carbonarius?CGMCC?3.879制成固定化增殖細(xì)胞；

(4)將炭黑曲霉制成的固定化增殖細(xì)胞和枯草桿菌產(chǎn)出的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶一起，以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖為底物，將葡萄糖-6-乙酯轉(zhuǎn)化為蔗糖-6-乙酯；

(5)最后用DTF-01色譜分離、用樹脂柱純化蔗糖-6-乙酯，可以獲得85％純度產(chǎn)品。

2.如權(quán)利要求1所述的利用生物發(fā)酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步驟(1)所述的巨大芽胞桿菌發(fā)酵葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比組成為：葡萄糖4.0％～10.0％，酵母粉0.1％～0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，磷酸氫二鉀0.05％，七水硫酸鎂0.05％，磷酸氫二銨0.1％，氯化鉀0.02％，七水硫酸亞鐵0.002％，三水乙酸鈉0.001％～0.002％，六水氯化鈷0.001％～0.002％，碳酸鈣0.5％。

3.如權(quán)利要求1所述的利用生物發(fā)酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步驟(2)所述的對(duì)枯草桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有質(zhì)量百分比組成為：蔗糖4.0％～10.0％、酵母粉0.3％～0.5％、氯化鉀0.05％～0.1％和六水氯化鈷0.001％～0.003％，于30～32℃、搖床轉(zhuǎn)速170～190r/min和pH為6.5～7.0的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)26～35h獲得菌體，按常規(guī)方法提取特異性果糖基轉(zhuǎn)移酶，再以殼聚糖凝膠為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，按常規(guī)化學(xué)交聯(lián)法制成固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。

4.如權(quán)利要求1所述的利用生物發(fā)酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步驟(3)所述的將炭黑曲霉制成固定化增殖細(xì)胞，是該菌株按CGMCC推薦的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)而獲得菌體后，取25～28g濕菌體與50mL去離子水配制成菌體懸浮液，加入陽離子聚丙烯酰胺PAM質(zhì)量百分比為0.2％～0.4％水溶液200ml，攪拌2～3min，再加入質(zhì)量百分比為3％～3.5％海藻酸鈉水溶液200ml，用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用多頭造粒器向攪拌下的濃度為0.1～0.2mol/L的無菌CaCl₂溶液滴注，冰箱4℃下固化24h，制得直徑2.5～3.5mm的珠型固定化細(xì)胞，然后用去離子水洗3～5遍；在無菌條件下移入含有250ml培養(yǎng)基的500ml三角瓶中培養(yǎng)30～32h，使菌株進(jìn)一步增殖，制成固定化增殖細(xì)胞。

5.如權(quán)利要求1所述的利用生物發(fā)酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步驟(4)所述的將炭黑曲霉的固定化增殖細(xì)胞和固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶一起，以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖為底物，將葡萄糖-6-乙酯轉(zhuǎn)化為蔗糖-6-乙酯，是在500ml三角瓶中，加入pH＝6.0～6.5的磷酸鹽緩沖液200ml，加入蔗糖20克和葡萄糖-6-乙酯10克，在180～200r/min搖床轉(zhuǎn)速下升溫至30～32℃；然后加入128～150單位u的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，同時(shí)按質(zhì)量比為1∶20的配比加入固定化增殖細(xì)胞，以及1.5～2克食品級(jí)碳酸鈣粉末；在30～32℃下反應(yīng)，于10～30h時(shí)間段內(nèi)每隔一定時(shí)間取出反應(yīng)液50μl，離心取上清液按第一步的HPLC色譜法檢測(cè)底物和產(chǎn)物的含量；當(dāng)蔗糖-6-乙酯的含量達(dá)到最高值后，停止反應(yīng)，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)，真空干燥得到蔗糖-6-乙酯粗品。

6.如權(quán)利要求1所述的利用生物發(fā)酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是步驟(5)所述的用DTF-01色譜分離用樹脂柱純化蔗糖-6-乙酯，以樹脂為填料，該樹脂用無鹽水溶脹后，用1～1.5mol/L的鹽酸浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的CaCl₂浸泡2h，水洗至中性；將水除去，用丙酮浸泡2h，將丙酮除去；用70％丙酮水溶液平衡，得到處理好的色譜分離樹脂；色譜柱的徑高比為1∶33～1∶38，濕法裝柱，用70％丙酮水溶液為洗脫液；蔗糖-6-乙酯粗品用少量洗脫液溶解后上柱，加樣量為5.0～6.0g，洗脫速度為1.0ml/min～1.5ml/min，洗脫液用分流器按30∶1分流，其中30份用自動(dòng)部分收集儀收集，1份連接HPLC跟蹤測(cè)定流出液的ELSD信號(hào)，并記錄對(duì)應(yīng)的流出液體積(ml)；收集HPLC跟蹤顯示含蔗糖-6-乙酯的流出液部分，旋轉(zhuǎn)減壓蒸去溶劑，真空干燥得到蔗糖-6-乙酯產(chǎn)品，純度達(dá)到85％以上。