[發明專利]一種檢測肺炎支原體的LAMP試劑盒

有效

• 申請號: 201210112439.4
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN102618655A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 趙飛;張建中;顧一心;陶曉霞;何利華;孟凡亮;肖迪
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說涉及一種檢測肺炎支原體的環介導等溫擴增技術(LAMP)試劑盒。

背景技術

肺炎支原體(Mycoplasma?pneumoniae，Mp)是引起人類呼吸道感染的重要病原菌，約10％～40％的社區獲得性肺炎(CAP)是由Mp感染引起的。嬰幼兒由于免疫功能相對低下，更容易引起重癥Mp感染，甚至引起肺炎支原體腦炎等嚴重感染。近幾年國內報道的Mp感染引起的肺炎發病率比重不斷升高，給社會造成的疾病負擔日趨明顯。鑒于肺炎支原體分離培養困難，目前其檢測方法主要依靠血清學檢測和核酸檢測。由于血清學技術主要針對抗體進行檢測，有明顯的滯后性，且受個體免疫差異影響大，所以檢測靈敏度和特異度較差。

隨著分子生物學的發展，目前已有多種PCR方法用于肺炎支原體的檢測，包括：普通PCR，巢式PCR，熒光PCR等，這些雖在靈敏度方面有所改進，但由于核酸檢測需要較嚴格的檢測環境，需要精密儀器的配套使用，檢測費用較高，同樣也無法滿足基層和現場檢測的需求。

環介導等溫核酸擴增技術(loop-mediated?isotherm?amplification，LAMP)是由Notomi于2000年開發的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA?polymerase)和兩對特殊的引物，特異地識別靶序列上的6個獨立區域，在等溫條件下(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。Hong?TC等人(2004)根據LAMP的原理設計了實時定量LAMP方法，以快速檢測SARS-CoV，結果LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；Masaki?Imai等人(2007)建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的LAMP檢測體系。

LAMP還可以檢測細菌、真菌等病原微生物，其靈敏度和特異性都有很好的體驗。但目前尚未見基于顏色判定的LAMP方法在肺炎支原體檢測中的應用。

發明內容

本發明的目的是提供用于檢測肺炎支原體的特異性LAMP引物組。

本發明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、可視化的、操作簡單的LAMP檢測試劑盒。

本發明提供了一種用于檢測肺炎支原體(Mycoplasma?pneumoniae)的靶序列，其具有SEQ?ID?NO.5所示的序列或其特異性片段。

本發明提供了用于擴增SEQ?ID?NO.5所示靶序列的特異性引物組合。

本發明提供了一種用于檢測肺炎支原體的特異性LAMP引物組合，包括以下4條引物：

F3：5’-TCTTACCACTGTTAACGGCC-3’；

B3：5’-CCGCTTTGGTCAACACATCA-3’；

FIP：5’-ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’；

BIP：5’-AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3’。

本發明提供了上述引物組在制備肺炎支原體的檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。

本發明提供了一種含有上述4條引物的檢測試劑。

本發明提供了一種含有上述4條引物的肺炎支原體的LAMP檢測試劑盒。

本發明的試劑盒還包含變色指示劑羥基萘酚藍(HNB)。

本發明還提供了上述試劑盒在檢測肺炎支原體中的應用。

上述試劑盒在檢測肺炎支原體中的應用中，25μL?LAMP檢測體系的具體配置為：10mM?dNTP混合溶液2.5μl，3mM羥基萘酚藍1μl，4M甜菜堿1μl，8U/μl?Bst酶1μl，10×Bst?buffer2.5μl，10μM?F3引物0.5μl，10μM?B3引物0.5μl，100μM?FIP引物0.4μl，100μM?BIP引物0.4μl，150mM硫酸鎂1μl，去核酸水13.2μl，模板1μl。

進一步地，檢測反應條件為：63℃恒溫1h，85℃3min，然后終止反應。

本發明試劑盒還包含陰性對照和陽性對照，所述陰性對照為去核酸水，所述陽性對照為肺炎支原體基因組DNA。每次檢測標本時必須設立NEG對照(陰性對照)和POS對照(陽性對照)，兩種對照對于結果判讀起決定性作用：

有效擴增：NEG(-)和POS(+)

無效擴增：NEG(+)和POS(+)提示體系污染