[發(fā)明專利]一種番茄遺傳轉(zhuǎn)化的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210112183.7 | 申請日： | 2012-04-17 |
| 公開（公告）號： | CN103074364A | 公開（公告）日： | 2013-05-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 徐洪偉;周曉馥;呂杰 | 申請（專利權(quán)）人： | 吉林師范大學 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;A01H5/00 |
| 代理公司： | 吉林省長春市新時代專利商標代理有限公司 22204 | 代理人： | 石岱 |
| 地址： | 136000 吉林*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 番茄 遺傳 轉(zhuǎn)化 方法 | ||
1.一種番茄遺傳轉(zhuǎn)化的方法，該方法是采用番茄種子整體侵染的方法實現(xiàn)的，步驟包括：①?測成熟番茄種子的生理吸脹曲線，②?含有目標基因的發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)，③?番茄種子的消毒滅菌，④?結(jié)合番茄種子的生理吸脹曲線，將經(jīng)消毒滅菌的成熟番茄種子轉(zhuǎn)入到OD600值為0.8-1.3的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中振蕩侵染7-9小時，⑤?在25℃黑暗條件下共培養(yǎng)3天，⑥?抗性植株的篩選，⑦?抗性植株的生根及培育，⑧?轉(zhuǎn)化植株煉苗及移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種番茄遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：
步驟?①?所述測成熟番茄種子的生理吸脹曲線的方法是：取8份等量的成熟番茄種子，每隔2小時取1份浸泡到水中，分別浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小時，記錄番茄種子的吸脹停滯點為7-9小時；
步驟?②?所述含有目標基因的發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)的方法是：將發(fā)根農(nóng)桿菌A4在LB固體培養(yǎng)基平板上接種活化2次，挑取該菌株的單菌落接種到5?ml?含有50?ug·ml-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26?oC、振蕩轉(zhuǎn)速160-200?rpm?的條件下，培養(yǎng)5-8小時，然后取1?ml?轉(zhuǎn)接于50?ml?含有50?ug·ml-1卡那霉素和110?umol·L-1乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26?oC、振蕩轉(zhuǎn)速160-200?rpm?的條件下，培養(yǎng)12-16小時后，取50?ml菌液加入到離心管中，置于低溫冷凍離心機中，在溫度25?oC、轉(zhuǎn)速3500?rpm條件下離心10?分鐘，棄上清液，得菌體沉淀，用含6?mg·L-1?6-BA?和?110?umol·L-1乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸上述菌體沉淀至OD600值為0.8-1.3備用；
步驟③?所述番茄種子滅菌的方法是：挑選飽滿的番茄種子，蒸餾水浸泡1.5-2小時，Cl2滅菌20分鐘，無菌水沖洗5-6次，準備侵染用；
?步驟④?所述結(jié)合番茄種子的生理吸脹曲線，侵染番茄種子7-9小時的方法是：結(jié)合番茄種子的生理吸脹曲線，將經(jīng)消毒滅菌的成熟番茄種子轉(zhuǎn)入到裝有步驟②?制備的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的無菌三角瓶中，農(nóng)桿菌菌液量以剛浸沒番茄種子為準，用封口膜封住瓶口，置于搖床中，于26?oC，166?rpm條件下振蕩培養(yǎng)7-9小時；
?步驟⑤?所述的共培養(yǎng)的方法是：待步驟④?侵染7-9小時后，從搖床中取出三角瓶置于超凈工作臺內(nèi)，倒掉菌液，加入無菌水沖洗3次后，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25?℃黑暗條件下，共培養(yǎng)3天；共培養(yǎng)的培養(yǎng)基是指：在MS培養(yǎng)基中加入?6?mg·L-1?6-BA?和?110?umol·L-1?乙酰丁香酮?和?7?g·L-1?瓊脂，pH值5.80-5.82；
步驟⑥?所述抗性植株的篩選其方法是：將經(jīng)步驟⑤?共培養(yǎng)的種子，轉(zhuǎn)接到壓力篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)1.5-2個月，獲得抗性植株；壓力篩選培養(yǎng)基是由1/2MS?培養(yǎng)基中加入?0.2?mg·L-1?6-BA?和1?mg·L-1?IBA和?250?mg·L-1?Cef?和50-100?mg·L-1?Kan?組成；
?步驟⑦?所述抗性植株的生根及培育的方法是：將步驟⑥?篩選之后成活的抗性植株接種在生根培養(yǎng)基上進行生根及培育，置于光照強度為2000?lx，光照時間為12?day?/?8?night?的人工氣候箱中培養(yǎng)20-30天；生根培養(yǎng)基是由1/2MS培養(yǎng)基加入?0.4?g·L-1?活性炭組成；
?步驟⑧?所述轉(zhuǎn)化植株煉苗及移栽的方法是：當步驟⑦?獲得的植株根長達到8?cm左右時，置于溫室內(nèi)開蓋2-3天，然后用鑷子將苗夾出，用過夜的自來水將植株根部的瓊脂洗干凈，移栽到花土中，移栽之后第1-2周內(nèi)保持土壤濕度80%左右，且置于有一定光照的陰涼處，不可被陽光直射，2周后，栽入花盆中，在溫室培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求2所述番茄遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：步驟?②?所述含有目標基因的發(fā)根農(nóng)桿菌是含有Gt基因的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株。
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