[發明專利]一種紫薇屬植物莖尖染色體制片方法

有效

• 申請號: 201210111914.6
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN102645360A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 潘會堂;楊冰潔;張啟翔;程堂仁;王佳;孫明
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及植物染色體制片方法，具體涉及紫薇屬莖尖染色體制片方法。

背景技術

紫薇屬植物(Lagerstroemia)隸屬于千屈菜科(Lythraceae)，其主要種如大花紫薇、尾葉紫薇等都是我國夏季重要的觀賞花木。與其他園林花卉相比，紫薇屬染色體研究要落后很多，且該屬植物多為中小染色體，不易染色，經典的細胞學手段難以識別其染色體，從而限制了深入理解紫薇屬分子細胞遺傳學機制研究的進行。

因紫薇屬植物多為非整倍體且染色體較小(Graham?and?Cavalcanti，2001)，所以此屬植物染色體數目報道不統一，Bowden認為紫薇與大花紫薇染色體數目均為2n＝50(Bowden，1945)；Guha卻認為其染色體數目僅為2n＝48(Guha，1972).國內幾種重要染色體圖譜中對紫薇屬植物染色體數目記載也各不相同，主要集中在2n＝50或2n＝48.宋平(2009)、童俊(2009)等在紫薇多倍體倍性鑒定時均采用常規壓片法，目前尚未有人對紫薇染色體的制片技術進行系統研究。

紫薇屬植物由于細胞壁較厚且染色體小而多，使用常規壓片法時會因預處理液及解離液的毒害作用而使染色體更加短縮，并且在壓片過程中染色體易重疊，不易獲得清晰分裂相，難以達到熒光原位雜交實驗所需染色體的標準，不利于實驗的進行。因此，使用常規壓片方法制得的染色體壓片只能用于常規觀察計數及初步核型分析，無法通過熒光原位雜交進行精確核型分析，迫切需要一種新的染色體制片技術，其制片能夠滿足熒光原位雜交精確核型分析的需要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種紫薇屬莖尖染色體制片方法，以克服現有技術的不足。

本發明提供一種紫薇屬植物(Lagerstroemia)莖尖生長點染色體制片方法，包括以下步驟：

(1)取紫薇屬莖尖生長點于固定液中固定；

(2)將固定后的莖尖生長點用蒸餾水洗凈轉移至前低滲溶液處理；

(3)蒸餾水洗凈吸干水分，于混合酶液中酶解；

(4)將酶解后的莖尖生長點用蒸餾水潤洗，低滲處理；

(5)將低滲處理后的莖尖置于載玻片，滴加步驟(1)所述的固定液，壓碎莖尖，烤干載玻片；再次滴加固定液，再次烤干；冷卻后滴加熒光染液染色；滴加熒光封片液。

其中，步驟(1)為選取紫薇屬一年生枝條莖尖生長點或初冬修剪經冷藏處理的枝條水培后新發出的莖尖生長點最內側長度為0.5～1.0cm的莖尖部分。

其中，步驟(1)的取材時間優選為上午9:00～11:00。

其中，步驟(1)固定液其配方為無水乙醇∶冰醋酸∶三氯甲烷體積比為5∶3∶2。

所述冰醋酸、三氯甲烷均為分析純。

其中，步驟(1)固定時間為18～24h。

其中，步驟(1)固定條件優選為-20℃。

其中，步驟(2)前低滲溶液為0.075mol/L的KCl。

其中，步驟(2)前低滲溶液處理時間為20～30min。

優選地，前低滲溶液處理時間為30min

其中，步驟(3)混合酶液為2.5％纖維素酶∶2.5％的果膠酶∶0.01％蛋白酶K按體積比2∶1∶3配制得到。

其中，步驟(3)酶解條件為37℃水浴酶解4～5h。

其中，步驟(4)低滲處理的時間為20～30min。

優選地，低滲處理時間為30min。

步驟(4)采用雙蒸水進行低滲處理。

其中，步驟(5)的第一次烤干載玻片前，是將壓碎莖尖后，棄去大塊的組織，趁材料未干時加一滴固定液，使剩余組織均勻涂布于載玻片上，酒精燈火焰上微微加熱烤干。

其中，步驟(5)所述的熒光染液為2μg/mL?DAPI熒光染液，加入量為20μL，染色時間為10min。

其中，步驟(5)中染色后，沖去染液，滴加熒光封片液，得到具有紫薇屬莖尖染色體的玻片。

本發明提供了制的具有紫薇屬莖尖染色體的玻片。

本發明提供了上述制片方法在紫薇屬基因組功能學中的應用。