[發明專利]一種阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210110348.7
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN103374541A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 何璟;王珊
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/76;C12P21/02;C12R1/465
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種阿嗪霉素的基因工程菌WSD2CP，其特征在于：Streptomyces?sahachiroi菌株WSD2CP，CCTCC，CCTCC?M2012098。

2.權利要求1所述的一種阿嗪霉素的基因工程菌WSD2CP的制備方法，其步驟是：

A、Streptomyces?sahachiroi?ATCC33158中aziD2基因缺失突變株的構建：

????構建同框缺失質粒，以含有aziD2基因的鏈霉菌基因組文庫質粒為模板，分別擴增大小為2.8?kb的同源左臂片段：aziD2L-for上游引物AAAAAGCTTCGCCTACGACGACCCCGACTAC?TC；aziD2L-rev下游引物，AAATCTAGATTCGAGTCCGTGTCCGAGGCGTTC和大小為2.5?kb的同源右臂片段：aziD2R-for上游引物，AAATCTAGATGACTCCGGTCGGCCCACATTCAC；aziD2R-rev下游引物AAAGAATTCGGCAAGGTCACTCAAGACGGAACT，分別用兩個片段上所設計的酶切位點進行處理后，通過三片段的連接方式，插入到自殺型載體pOJ260的克隆位點HindIII和EcoRI上，得到aziD2基因的同框缺失質粒pMSB-WS31，通過接合轉移的方法將質粒pMSB-WS31導入到Streptomyces?sahachiroi?ATCC33158中，得到阿伯拉霉素抗性的單交換接合子，將接合子在無抗性的平板上松弛培養三代，收集孢子后于無抗平板上進行稀釋涂布，影印到含有阿伯拉霉素的抗性平板上培養，挑出對阿伯拉霉素的菌株，抽總DNA用相應的引物：上游引物序列為AAATCTAGACCGCTGCATCCGCCACG?CAAATACCTG，下游引物序列為AAAAAGCTTCTCAACGGGC?GCAAGACCTACAACC進行PCR驗證，野生型菌株ATCC33158的總DNA擴增出1.8?kb的特征帶，aziD2基因缺失的菌株WSD2的總DNA能擴增出1.0?kb的特征帶；

B、aziD2基因表達質粒的構建：

aziD2基因表達質粒的構建是基于鏈霉菌表達質粒pMSB-WS052進行，質粒pMSB-WS052是由鏈霉菌整合型載體pSET152改造，其多克隆位點上游具有組成型強啟動子PermE*，表達載體pWS052構建方法如下：設計特異性引物：Perm-SpeI上游引物，TTGACTAGTGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT；Perm-EcoRV下游引物，AAAGATATCTCTGGCTCACCGA?CGACCCGC，以質粒pWHM4*為模板擴增得到含有啟動子ermE*的片段，用引物上所設計的酶切位點處理后，插入到pSET152的XbaI和EcoRV位點間，得到載體pMSB-WS052，通過PCR的方法，以含有aziD2基因的鏈霉菌基因組文庫質粒為模板，擴增大小為1.1?kb、包含RBS區域及aziD2基因編碼區的DNA片段：aziD2-SpeI上游引物，ATTACTAGTATTCTGAGCAGCGCCCGGGTATTCAC；aziD2-XbaI下游引物AAATCTAGACGGGATGCCA?GCGGAACGGTGAATGTG，用XbaI+SpeI酶切處理后，以正確的方向插入到載體pMSB-WS052的XbaI位點上，獲得aziD2基因的表達質粒pWS052-D2；

C、?aziD2基因互補表達菌株WSD2CP的構建：

通過接合轉移的方法將aziD2基因表達質粒pWS052-D2導入到aziD2基因缺失的菌株WSD2中，用阿伯拉霉素抗性篩選目的菌株，并用aziD2基因的擴增引物：aziD2-SpeI上游引物，ATTACTAGTATTCTGAGCAGCGCCCG?GGTATTCAC；aziD2-XbaI下游引物AAATCTAGACGGGATGCCA?GCGGAACGGTGAATGTG進行PCR驗證，以互補菌株的總DNA為模板，擴增出1.1?kb的特征帶，得到了反式互補aziD2基因的菌株WSD2CP。

3.權利要求1所述的一種阿嗪霉素的基因工程菌WSD2CP在發酵生產中的應用。