[發(fā)明專利]瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測用引物及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210109529.8
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN102758005A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設計）人: 趙文軍;田茜;張靚;尤其敏;商明清;朱水芳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院;杭州優(yōu)思達生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京億騰知識產(chǎn)權代理事務所 11309
• 代理人: 陳惠蓮

技術領域

本發(fā)明“瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測用引物及方法”，專用于檢測瓜類果斑病菌，屬于植物檢疫技術領域，涉及生物檢測技術。

背景技術

瓜類果斑病自1989年在美國的西瓜種植區(qū)被發(fā)現(xiàn)后，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重經(jīng)濟損失。瓜類果斑病病原為Acidovorax?citrulli，是我國進境植物檢疫性有害生物，可通過種子進行遠距離傳播。其主要寄主包括西瓜、甜瓜、哈密瓜、西葫蘆等葫蘆科作物，染菌種子是疫情爆發(fā)的主要原因。控制病害發(fā)生的最佳途徑是種植健康的種子。該病菌的檢測方法主要有種植觀察、分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附法、實時熒光PCR等。但以上檢測手段存在著操作過程耗時長、儀器配置昂貴等不利于在基層單位推廣的制約因素。

根據(jù)瓜類果斑病菌16S?rDNA序列設計了5條引物，建立了瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測技術，反應結(jié)束后利用封閉式的膠體金標記DNA檢測裝置進行結(jié)果判定。

發(fā)明內(nèi)容

技術問題

本發(fā)明的目的在于提供用于瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測用引物序列及方法，以達到快速、準確檢測瓜類果斑病菌的目的。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：本發(fā)明通過分析已報道的瓜類果斑病菌16S?rDNA序列(GenBankAY702093.1)分別設計了5條引物。經(jīng)過一步恒溫擴增后，擴增產(chǎn)物通過商品化一次性全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置進行結(jié)果判讀，即可判斷檢測樣品中是否含有瓜類果斑病菌。

技術方案

本發(fā)明涉的瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測方法包括如下步驟：

1)用于檢測瓜類果斑病菌的樣品制備

利用商業(yè)化植物DNA提取試劑盒提取樣品總DNA或通過分離得到細菌菌液為模板。

2)用于檢測瓜類果斑病菌的一套交叉擴增引物

本發(fā)明通過分析已報道瓜類果斑病菌16S?rDNA序列，分別設計了5條引物，其核苷酸序列如下：

ACLF3：5’-GGCTAACTACGTGCCAGC-3’

ACLB3：5’-ACGCATTTCACTGCTACA-3’

ACLBIP：5’-CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’

ACDF5b1：5’-GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’

ACDF5f2：5’-CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3’

其中引物ACDF5b1的5端生物素標記，引物ACDF5f2的5端FITC標記。

3)恒溫擴增的反應體系

20μl的反應體系中包含：0.8μmol/L交叉引物ACLBIP；0.1μmol/L正向檢測引物ACDF5b1(5端生物素標記)，0.3μmol/L反向檢測引物ACDF5f2(5端FITC標記)，各0.1μmol/L的兩條置換引物ACLF3和ACLB3，0.4mmol/L?dNTP，2μl?10×反應緩沖液；8個單位的Bst?DNA聚合酶，2mmol/L?MgSO₄，以及4μl的目標DNA。

4)恒溫擴增程序

擴增反應為63℃，60min。

5)擴增產(chǎn)物結(jié)果判讀

擴增產(chǎn)物通過商品化一次性全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置進行結(jié)果判讀。通過觀察試紙條的檢測條帶和質(zhì)控條帶的顯色與否進行結(jié)果判讀。

附圖說明

圖1運用交叉引物恒溫擴增檢測瓜類果斑病菌靈敏度的測試實驗結(jié)果。(1：3.7×10⁵cfu/ml，2：3.7×10⁴cfu/ml，3：3.7×10³cfu/ml，4：空白對照)。

圖2運用交叉引物恒溫擴增技術對西瓜種子中瓜類果斑病菌檢測的代表性實驗結(jié)果(1-6為帶菌西瓜種子檢測結(jié)果，7為空白對照)。

具體實施方式

下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1引物的設計和合成

根據(jù)瓜類果斑病病菌16S?rDNA序列設計了5條引物，引物序列為：

ACLF3：5’-GGCTAACTACGTGCCAGC-3’

ACLB3：5’-ACGCATTTCACTGCTACA-3’

ACLBIP：5’-CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’