[發明專利]一種突變的中性植酸酶及其基因和用途

有效

• 申請號: 201210108972.3
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN102649950A
• 公開（公告）日: 2012-08-29
• 發明（設計）人: 許偉;邵榮;路國偉;余曉紅
• 申請（專利權）人: 鹽城工學院
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;A23K1/165;C12R1/19;C12R1/07
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技術領域

本發明屬于酶的基因工程和酶生化工程領域。本發明涉及活性提高的突變中性植酸酶，本發明還涉及編碼該突變中性植酸酶的基因及用途。

背景技術

磷是動物必需的一種常量礦物元素，磷的添加對配合飼料生產成本及產品質量有重要影響。植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸酶(myo-inositol?hexaphosphate?phosphohydrotase)是催化植酸及其植酸鹽水解產生肌醇和磷酸(或者磷酸鹽)這類酶的總稱。添加植酸酶能夠顯著提高植物性飼料中磷的利用率，減少飼料中無機磷的添加量以及動物糞便中無機磷的排出，減輕環境的磷污染，提高畜牧生產和生態效益。

目前從微生物中獲得植酸酶的報道有以下三種：(1)來源于大腸桿菌的雙功能酶(appA)，它具有植酸酶和磷酸酶的功能，但只在酸性條件下表現出強的植酸酶活性；(2)來源于黑曲霉的酸性植酸酶(phyA)具有較高的活性，其酶促反應的pH有效范圍在4.5-6.0之間，適用于胃呈酸性的單胃動物及少數魚類；(3)來源于芽孢桿菌的中性植酸酶(phyC)，最適酶促反應pH在7.0-7.5之間適用于消化道為中性的鯉科魚類，可有效彌補酸性植酸酶的不足。

國內外科研人員對中性植酸酶的研究主要集中于產酶菌篩選和基因工程菌的構建方面。姚斌等從枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis中克隆了中性植酸酶基因，并在大腸桿菌中進行了表達，表達產物具有生物學功能但比活較原始酶下降了30％(姚斌，袁鐵錚，王元火，等.來源于Bacillus?subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大腸桿菌的表達.生物工程學報，2001，17(1)：11-15)。陳艷等(陳艷，孫健義，趙學新，等.Bacillus?amyloliquegaciens中性植酸酶基因的原核表達及蛋白純化和性質.食品與生物技術學報，2005，24(2)：60-65.)將來源于淀粉液化芽孢桿菌的植酸酶在大腸桿菌中進行了表達，結果發現基因工程菌的植酸酶活性僅為出發菌株的1.27倍，表達重組酶活性偏低。近年來，Rao等(Rao?DE，Rao?KV，Reddy?VD.Cloning?and?expression?of?Bacillus?phytase?gene(phy)in?Escherichia?coli?and?recovery?of?active?enzyme?from?the?inclusion?bodies.Journal?of?Applied?Microbiology.2008，105(3)：1128-1137.)在大腸桿菌中對芽孢桿菌中性植酸酶進行了高效表達，結果表明其最適pH為7.0，最適溫度55℃，最大活性16U/mg。Tung等(Tung?ET，Ma?HW，Cheng?C，et?al.Stabilization?of?beta-propeller?phytase?by?introducing?Xaa-->Pro?and?Gly-->Ala?substitutions?at?consensus?positions.Protein?Pept.Lett.，2008，15，297-299.)運用定點突變方法對Bacillus?licheniformis植酸酶的熱穩定性進行了改善，取得了較好的效果。定點突變結果表明，突變酶G117A/G266A與野生酶具有類似的米氏常數K_m，催化效率k_cat和最適的Ca²⁺濃度，但是熱穩定性有大幅上升。

定點突變是蛋白質工程廣泛采用的技術，它是根據酶的結構、功能和作用機理等信息，在基因水平進行核苷酸突變，以達到改造酶分子中特定氨基酸殘基的目的，使酶的性質最佳化。利用生物信息工具進行蛋白質分子設計，并結合定點突變技術提高淀粉液化芽孢桿菌Bacillus?amyloliquefaciens?DSM?1061中性植酸酶的活性，尚未見有關文獻報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種突變的中性植酸酶，該突變的中性植酸酶與野生酶相比，在pH6.0～7.5下活性增加25-35％。

本發明的另一個目的是提供編碼上述突變中性植酸酶的基因(核苷酸序列)，該突變的中性植酸酶基因可用于構建重組菌。

本發明的再一個目的是提供上述突變中性植酸酶的生產方法。

上述突變中性植酸酶核苷酸序列與野生酶核苷酸序列(GenBank登錄號為HM747163)相比，第148位的編碼天冬氨酸的密碼子突變為編碼谷氨酸的密碼子。

本發明的目的可以通過以下措施達到：