[發明專利]LC-MS非靶向性煙草代謝組學樣品提取方法

無效

• 申請號: 201210108435.9
• 申請日: 2012-04-14
• 公開（公告）號: CN102636594A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 金立鋒;楊軍;翟妞;周會娜;李鋒;羅朝鵬;王燃;許亞龍;曹培健;林福呈
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

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技術領域

本發明涉及煙草代謝組學樣品提取方法，本發明以LC-MS為分析平臺，對影響煙草提前效果的四個因素在三個水平上進行正交設計，分別采用了ESI（+，-）離子模式，分析出最佳的適合煙草葉片的最佳提取方法。

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背景技術

代謝物作為生物體中的終產物，在很多時候其差異比生物體相應的轉錄和蛋白質水平顯示的差異要大，是代謝組學分析較之其他“組學”的優勢之一（漆小泉，王玉蘭，陳曉亞，2011，植物代謝組學-方法與應用，P58-60，化學工業出版社）。同時也正是因為生物代謝途徑對外界環境擾動的敏感，造成不同生物個體之間的代謝物組成及含量差異很大。已經有研究表明，即便是在嚴格控制的生長條件下，分析樣品之間代謝組的生物差異也要高于其他系統差異好幾倍（Roessner?et?al.,?2000）。所以在樣品取材、提取方法及分析方法盡量保持一致，以盡量避免引入系統誤差。代謝組學研究中最容易引入系統誤差的是樣品制備過程，標準的植物代謝物樣品制備分為組織取樣、勻漿、抽提、保存和樣品預處理等步驟（Fukusaki?and?Kobayashi,?2005）。代謝產物通常用水和有機溶劑（如甲醇和乙腈等）分別提取，獲得水提取物和有機溶劑提取物，從而把非極性的親脂相和極性相分開。然而植物代謝物千差萬別，其中很多物質稍受干擾，結構就會發生改變，且對其分析鑒定所采用的設備也不同。目前還沒有通用所有代謝物的抽提方法，只能根據所要分析的代謝物特性及使用的鑒定手段選擇合適的提取方法，同時抽提時間、溫度、溶劑成分和質量及實驗者的技巧等諸多因素也將影響樣品制備的水平。

煙草代謝組學研究國內外報道較少，對于其代謝組學樣品的提取方法沒有統一標準，因此建立高效、快速、重現性好得煙草代謝組學樣品提取方法對促進煙草代謝組學研究，加強相關研究者之間進行數據交流具有重要意義。

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發明內容

本發明的目的在于建立一種基于LC-MS煙草代謝組學樣品提取方法，實現煙草代謝組學樣品的快速、高效、快速提取。該技術具有分析方法簡單，檢測效率高、重現性好得特點。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

本發明的LC-MS非靶向性煙草代謝組學樣品提取方法包括以下工藝步驟：

1）植物勻質化方法：煙草樣品液氮冷凍，球磨儀打碎；

2）研磨好樣品加入75%酸化（0.1%蟻酸）甲醇，25℃下超聲提取20?min；

3）提取完樣品室溫下（20℃）高速（20?000g）離心10?min，上清用20?μm微孔濾膜過濾。

在本發明中，所述煙草樣品為新鮮組織樣品（非調制煙葉或花、根、莖等新鮮組織器官）。

液氮冷凍的溫度為-196℃，樣品需完全浸沒在液氮中。

本發明具有以下優點：

1.????提供了一種最適合煙草葉片的最佳提取方法，對促進煙草代謝組學研究、建立統一的提取方法標準、加強相關研究者之間進行數據交流具有重要意義。

2.????操作簡單、快捷，試劑相對便宜，毒性較小。

3.????獲得代謝物峰數據較大，切對樣品重現性較好。

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附圖說明

圖1為本發明工藝流程圖。

圖2為9種提取方法的實驗樣本TIC輪廓譜比較。

圖3為采用本發明方法對煙草白花突變體花瓣進行6次重復的進樣分析結果總粒子流色譜圖（Total?particles?chromatogram，TIC）

具體實施方式

本發明以下結合實施例做進一步描述

實施案例

1）??????????????不同提取方法提取效果比較

表1-1?影響代謝物提取效果的因素及各種水平