[發明專利]檢測耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其專用酶聯免疫試劑盒

有效

• 申請號: 201210107406.0
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102645535A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 韓庚辰;劉素霞;李雪峰;宋哲;徐曄潁;郭旻
• 申請（專利權）人: 北京奧瑞金種業股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/573
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種檢測耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其專用酶聯免疫試劑盒。

背景技術

草甘膦類除草劑是一種廣譜性、非選擇性除草劑，它通過抑制EPSPS(5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物體內芳香族氨基酸合成途徑中的一個重要酶)的活性，阻斷了植物莽草酸途徑的生物合成，強烈抑制細胞分裂，對許多一年生和多年生雜草都具有強烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中無殘毒，對動物無毒害，自從1976年Roundup研制成功以來，得到了廣泛的應用。但是，由于玉米等禾本科作物對草甘膦敏感，使其應用受到限制。因此，將耐草甘膦基因轉入作物，不但可以擴大草甘膦的使用范圍，而且可降低生產成本，保護作物免受藥害，最終達到增產增收的目的。

目前，國際上在耐草甘膦轉基因植物的研究方面，已經取得了突破性進展。美國孟山都(Mosanto)和Calegene等公司在基于對EPSP合成酶的編碼基因aroA的研究，已獲得耐草甘膦轉基因大豆、玉米、油菜和棉花等作物系列品種，其中大豆等多種轉基因作物已經進入商品化生產。Mosanto公司生產的耐草甘膦二型轉基因玉米在2007年的播種面積預計超過3200萬英畝，相當于美國玉米播種面積的40％。2004年，中國農業科學院生物技術研究所發現了一個新的耐草甘膦基因G2-aroA(中國專利，申請號03826892.2，授權公告號CN?100429311C)。目前尚沒有抗G2-aroA蛋白的單克隆抗體，也未見利用G2-aroA蛋白單克隆抗體鑒別轉G2-aroA基因植物的相關報道。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測耐草甘膦蛋白G2-aroA的酶聯免疫試劑盒。

本發明所提供的酶聯免疫試劑盒中含有獨立包裝的抗所述G2-aroA蛋白的單克隆抗體；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9；所述單克隆抗體由雜交瘤細胞株AntiG2-5F11產生；所述雜交瘤細胞株AntiG2-5F11在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.5772。

所述酶聯免疫試劑盒中還含有分別獨立包裝的抗所述G2-aroA蛋白的多克隆抗體和/或所述G2-aroA蛋白標準品和/或用于標記所述單克隆抗體的標記酶；所述多克隆抗體是以所述G2-aroA蛋白為免疫原免疫脊椎動物得到的。

在本發明的一個實施例中，所述多克隆抗體具體是以所述G2-aroA蛋白為免疫原免疫家兔(體重約2kg的新西蘭大耳白兔)得到的。所述G2-aroA蛋白標準品可為G2-aroA蛋白或由所述G2-aroA蛋白配制成的一系列不同濃度的G2-aroA蛋白溶液。所述一系列不同濃度的G2-aroA蛋白溶液具體可為從濃度為10μg/mL開始，按照2倍比進行稀釋所得的溶液。所述G2-aroA蛋白溶液的溶劑具體可為PBST。

所述酶聯免疫試劑盒中還含有分別獨立包裝的包被緩沖液和/或洗滌液和/或底物緩沖液和/或終止緩沖液和/或封閉液；

在本發明的一個實施例中，所述包被緩沖液具體為碳酸鹽緩沖液，其溶劑為水，Na₂CO₃和NaHCO₃；溶質Na₂CO₃和NaHCO₃在所述包被緩沖液中的濃度分別為15mM和35mM；所述包被緩沖液的pH為9.6。

在本發明的一個實施例中，所述洗滌液具體為PBST，其溶劑為水，溶質為Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和吐溫20；溶質Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl在所述洗滌液中的濃度分別為8.3mM、1.5mM和200mM；所述吐溫20在所述洗滌液中的體積百分含量為0.1％；所述洗滌液的pH為7.5。

在本發明的一個實施例中，所述底物緩沖液具體為PNPP緩沖溶液，其溶劑為水，溶質為MgCl₂和二乙醇胺；溶質MgCl₂在所述底物緩沖液中的濃度為1mM；所述二乙醇胺在所述底物緩沖液中的體積百分含量為9.7％；所述底物緩沖液的pH為9.8。

在本發明的一個實施例中，所述終止緩沖液具體為3M的NaOH水溶液；