[發(fā)明專利]基于卵黃抗體的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210107100.5
• 申請(qǐng)日: 2012-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN102901816A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李登峰;彭嬌;周永強(qiáng);劉聯(lián)國(guó);陳炯;顧曉英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種基于卵黃抗體的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）抗原預(yù)包被

將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原用.01?M?的pH?為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至0.1?ng/ul，按100ul/孔加于聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中，4℃放置過(guò)夜，次日傾去孔內(nèi)液體，將孔用PBS-T洗滌液洗滌3次后，每孔加入1?%?牛血清白蛋白封閉液，37?℃低速振蕩溫育1?h進(jìn)行封閉，封閉結(jié)束后，吸走孔內(nèi)牛血清白蛋白封閉液；

（2）檢測(cè)反應(yīng)

將孔用PBS-T洗滌液清洗后，加入倍比稀釋的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體100ul，每梯度設(shè)1平行，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陰性對(duì)照，加蓋37?℃溫育1?h后，用PBS-T洗滌液洗3次，再在每孔中加入100ul的預(yù)先用1%牛血清白蛋白封閉液按1：10000比例稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗雞IgG，37?℃溫育1?h后，PBS-T洗滌液清洗5次，蒸餾水洗3次后，每孔加入新配置好的鄰苯二胺底物溶液100ul，37?℃暗處顯色15?min，每孔加50ul的2M?H₂SO₄終止反應(yīng)；

（3）結(jié)果判定

在酶標(biāo)儀上讀取各孔492?nm波長(zhǎng)處的吸光度值，測(cè)定孔吸光度值大于陰性對(duì)照孔均值2.1倍以上者判為陽(yáng)性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于卵黃抗體的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于步驟（1）中所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原的制備過(guò)程如下：選取患病甲魚，取甲魚內(nèi)臟置于預(yù)先冰浴過(guò)的TNE緩沖液中，勻漿直至完全碎裂，將勻漿液在4℃，6000g條件下離心10min后，取上清液在4℃?，8000g條件下離心20min，取再次離心所得上清液于4℃，35000g離心1.5h后獲取一次沉淀物，將一次沉淀物的沉淀上層疏松部分用TM緩沖液小心沖洗掉，沉淀下層白色部分重懸于1ml的TM緩沖液中，4℃冰浴過(guò)夜；次日將過(guò)夜處理的沉淀重新懸浮起來(lái)，4℃下3500g條件下離心5min后，取上清液于4℃，38000g條件下離心1.5h獲取二次沉淀物，將二次沉淀物的沉淀上層疏松部分小心去掉后，下層白色沉淀用少量TM緩沖液重懸后制成病毒懸浮液，即為甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于卵黃抗體的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于步驟（2）中所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體的制備過(guò)程如下：

a．蛋雞免疫并收集免疫雞蛋

將蛋雞進(jìn)行1次基礎(chǔ)免疫和2～3次加強(qiáng)免疫，所述的基礎(chǔ)免疫為在所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化后對(duì)蛋雞進(jìn)行注射免疫，所述的加強(qiáng)免疫為在所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐劑，充分乳化后對(duì)蛋雞進(jìn)行注射免疫，注射用量為每千克母雞注射500mg甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原，每次免疫間隔時(shí)間為15天，完成免疫后10天，開始收集雞蛋，于4℃冰箱保存；

???b．特異卵黃抗體的提取

將上述得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼并分離卵黃，吸取卵黃液，然后在卵黃液中加入卵黃液10倍體積的0.05?M的?pH?為5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，混勻后于4?℃冰箱靜置過(guò)夜處理，將過(guò)夜處理后的混合液于4?℃，10000g的條件下離心20?min后取上清液，在上清液中加入飽和的（NH₄）₂SO₄使其終濃度為40%，4?℃靜置10h，再10000g離心20?min后取沉淀，將沉淀用140g/L的Na₂SO₄稀釋至100?ml，再次于4℃靜置10?h后，10000?g離心20?min，沉淀用0.01M?的pH?為7.2?的PBS重懸，最后用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得到甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于卵黃抗體的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于所述的TNE緩沖液的pH為7.5，配制終濃度如下：50?mM?Tris-HCl，200?mM?NaCl，5mM乙二胺四乙酸分，1mM?苯甲基磺酰氟。