[發(fā)明專利]一種人工合成的耐草甘膦基因及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210107071.2
• 申請(qǐng)日: 2012-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN102676553A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓庚辰;劉素霞;姜付坤;鄧德芝;宋哲;連肖華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京奧瑞金種業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/54
• 分類號(hào): C12N15/54;C12N9/10;C12N15/63;C12N1/21;C12N5/10;A01H5/00;C12N15/84
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種人工合成的耐草甘膦基因及其應(yīng)用，特別涉及一種根據(jù)玉米偏好密碼子設(shè)計(jì)并合成的耐草甘膦基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前在植物轉(zhuǎn)基因育種中所應(yīng)用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多來(lái)自原核生物，由于原核生物基因自身的特點(diǎn)，如1)AT含量較高，超過(guò)60％，造成基因表達(dá)的mRNA在植物體內(nèi)極易被降解；2)存在類似真核基因的內(nèi)含子切點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子序列，造成轉(zhuǎn)錄不完整、mRNA異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結(jié)構(gòu)與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5’-UTR序列和3’末端的polyA加尾序列，導(dǎo)致基因在植物體內(nèi)往往表達(dá)水平較低。例如，來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達(dá)量非常低，其表達(dá)的毒蛋白只占總蛋白的0.001％或者幾乎檢測(cè)不到。美國(guó)Monsanto公司的Perlak(Perlak?F?J，F(xiàn)uchs?R?L，Dean?D?A，et?al.Modification?of?the?coding?SEQ?ID?NO.uence?enhances?plant?expressing?of?insect?control?protein?genes.Proc?Natl?Acad?Sci?USA，1991，88：3324-3328)和Iannacone等(Iannacoe?R，Grieco?P?D，Cellini?F.Specific?SEQ?ID?NO.uence?modification?of?a?cry3B?endotoxin?gene?result?in?high?levels?of?expression?and?insect?resistance.Plant?Mol?Biol，1997，34：485-496)在不改變毒蛋白氨基酸序列的前提下，分別對(duì)殺蟲蛋白基因和cryIII基因進(jìn)行了改造，選用植物偏愛的密碼子，增加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不穩(wěn)定元件序列，使轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達(dá)量增加了30～100倍，高達(dá)可溶性蛋白的0.02～1％，獲得了明顯的抗蟲效果。

雜草是農(nóng)作物生產(chǎn)的大害，自1942年出現(xiàn)近代雜草防治技術(shù)以來(lái)，化學(xué)除草劑有了很大的發(fā)展。草甘膦類除草劑是一種廣譜性、非選擇性除草劑，它通過(guò)抑制EPSPS(5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物體內(nèi)芳香族氨基酸合成途徑中的一個(gè)重要酶)的活性，阻斷了植物莽草酸途徑的生物合成，強(qiáng)烈抑制細(xì)胞分裂，對(duì)許多一年生和多年生雜草都具有強(qiáng)烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中無(wú)殘毒，對(duì)動(dòng)物無(wú)毒害，自從1976年Roundup研制成功以來(lái)，得到了廣泛的應(yīng)用。

但是，由于玉米等禾本科作物對(duì)草甘膦敏感，使其應(yīng)用受到限制。因此，將耐草甘膦基因轉(zhuǎn)入玉米，不但可以擴(kuò)大草甘膦的使用范圍，而且可降低生產(chǎn)成本，保護(hù)玉米免受藥害，最終達(dá)到增產(chǎn)增收的目的。盡管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被發(fā)現(xiàn)，并在宿主熒光假單胞菌G2及大腸桿菌中都能高效表達(dá)，表現(xiàn)高耐草甘膦的特性(Yichen?Sun，Min?Lin?and?Yiping?Wang.Novel?AroA?with?high?tolerance?to?Glyposate，encoded?by?a?gene?of?Pseudomonas?putida?4G-1isolated?from?an?extremelypolluted?environment?in?China.Aplied?and?environmental?microbiology.2005，71(8)：4771-4776)，但其在植物，特別是重要的糧食作物中由于表達(dá)量較低而沒有被利用，因此急需對(duì)其在植物中的應(yīng)用進(jìn)行研究，如進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以加速其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種DNA分子，該DNA分子是耐草甘膦基因。

本發(fā)明所提供的DNA分子，名稱為mG2-aroA，其核苷酸序列為序列表中序列2。

根據(jù)需要，所述DNA分子的核苷酸序列也可為序列表中序列2的第1-1335位。

所述DNA分子的核苷酸序列還可為與序列表中序列2或序列2的第1-1335位至少具有98％的同一性，且編碼序列9所示蛋白質(zhì)(命名為G2-aroA蛋白)。

其中，序列2由1338個(gè)核苷酸組成，其末尾處為兩個(gè)終止密碼子。序列2的第1-1335位為編碼序列，編碼序列9所示的G2-aroA蛋白。序列9由444個(gè)氨基酸組成。