[發明專利]一種在哺乳動物細胞中生產DHA的方法

無效

• 申請號: 201210107024.8
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102660576A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 陳紅星;林艷麗;吳曉潔;周顏榮;熊富銀;孫曉燕;左珊珊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12P7/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種促進哺乳動物細胞生產DHA的試劑盒，包括線蟲(Caenorhabditis?briggssae)ω-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因和哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述線蟲(Caenorhabditis?briggssae)的ω-3脂肪酸去飽和酶基因為sfat1基因，所述sfat1基因的核苷酸序列為序列表中序列1；所述哺乳動物脂肪酸延長酶基因為小鼠脂肪酸延長酶基因，優選為小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2；所述哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因為小鼠脂肪酸去飽和酶基因，優選為小鼠Δ6desaturase基因，所述小鼠Δ6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還包括真核表達載體，所述真核表達載體為pCAGGS；所述試劑盒還包括抗性篩選標記基因；所述抗性篩選標記基因包括zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5′端第564-938位核苷酸，優選為自序列表中序列4的5′端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5′端第567-1370位核苷酸，優選序列表中序列5；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5′端第178-1203位核苷酸序列，優選自序列表中序列6的5′端第114-1206位核苷酸。

4.一種制備DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系的方法，是將線蟲(Caenorhabditis?briggssae)ω-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因、哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因導入離體的哺乳動物細胞中，篩選獲得穩定整合及表達ω-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因、哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的哺乳動物轉基因細胞系，即為DHA生產能力提高的哺乳動物轉基因細胞系。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述線蟲(Caenorhabditis?briggssae)的ω-3脂肪酸去飽和酶基因為sfat1基因，所述sfat1基因的核苷酸序列為序列表中序列1；所述哺乳動物脂肪酸延長酶基因為鼠脂肪酸延長酶基因，優選為小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2；所述哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因為鼠脂肪酸去飽和酶基因，優選為小鼠Δ6desaturase基因，所述小鼠Δ6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3；所述哺乳動物細胞為鼠細胞，優選為中國倉鼠卵巢細胞K1。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述ω-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因和哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因先分別以真核表達載體為出發載體，分別構建得到表達ω-3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體、表達哺乳動物脂肪酸延長酶基因的重組表達載體和表達哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體，然后三個重組表達載體共轉染哺乳動物細胞系，篩選得到所述哺乳動物轉基因細胞系；所述真核表達載體為pCAGGS。

7.根據權利要求6中任意一項所述的方法，其特征在于：所述重組表達載體是以真核表達載體為出發載體，將所述真核表達載體先插入抗性篩選標記基因，構建具有抗性篩選標記的重組表達載體，然后插入所述ω-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動物脂肪酸延長酶基因或哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因，獲得表達ω-3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體、表達哺乳動物脂肪酸延長酶基因的重組表達載體或表達哺乳動物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達載體；所述抗性篩選標記基因為zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5′端第564-938位核苷酸，優選為自序列表中序列4的5′端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5′端第567-1370位核苷酸，優選序列表中序列5；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5′端第178-1203位核苷酸序列，優選自序列表中序列6的5′端第114-1206位核苷酸。

8.權利要求4-8中任意一項所述方法制備的哺乳動物轉基因細胞系。