[發(fā)明專利]一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210104903.5
• 申請(qǐng)日: 2012-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN102634541A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王潔華;王旭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征包括下述步驟：

(1)預(yù)培養(yǎng)：

將717楊樹腋芽或頂芽置于基本培養(yǎng)基上繼代繁殖，培養(yǎng)4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0.8-1.5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0.1-0.5cm²葉片的葉柄置于M1′培養(yǎng)基中，于24-26℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2-3天；

(2)菌種活化與培養(yǎng)：

用移液槍槍頭挑取-80℃保存的農(nóng)桿菌至含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，27-29℃倒置暗培養(yǎng)20-28h；挑取培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，27-29℃倒置暗培養(yǎng)36-48h；

挑取單菌落至含有抗生素的2-4mLYEB液體培養(yǎng)基的無菌試管中，150-200rpm?27-29℃暗培養(yǎng)12-16h；吸取0.1-1.0mL菌液至含有抗生素的50-75mLYEB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，150-200rpm?27-29℃暗培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6-0.8；

(3)侵染：

將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3500-4000rpm離心10-15min，棄去上清液，將沉淀用50-75mL?M液重懸，24-26℃，80-100rpm活化0.5-1h得到侵染液；按30-50個(gè)：25mL的比例將經(jīng)步驟(1)預(yù)培養(yǎng)的莖段或帶有葉片的葉柄放入所述侵染液中，24-26℃條件下80-100rpm侵染30-60min；

(4)共培養(yǎng)：

從侵染液中取出莖段或帶有葉片的葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在M1固體培養(yǎng)基上，24-26℃，暗條件下共培養(yǎng)2-3天；

(5)延遲選擇：

取出步驟(4)共培養(yǎng)的莖段或帶有葉片的葉柄，先用去離子水在180-220rpm下洗滌4-5min，洗滌2-3次，接著用濃度為350-500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌4-5min，洗滌2-3次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉(zhuǎn)移至CIM延遲選擇培養(yǎng)基中，24-26℃暗培養(yǎng)10-11天，取出更換至新的CIM延遲選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)24-26℃暗培養(yǎng)10-11天，得到帶有愈傷組織的莖段或葉柄；

(6)誘導(dǎo)不定芽：

將所述帶有愈傷組織的莖段或葉柄轉(zhuǎn)移至SIMa篩選培養(yǎng)基中，光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每15-20天更換一次培養(yǎng)基；待長出綠色愈傷組織0.2-0.5cm²，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有SIMb篩選培養(yǎng)基的組培瓶中，直到不定芽生長至1-2cm；

(7)伸長培養(yǎng)：

切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態(tài)的不定芽，轉(zhuǎn)移至含有SEM篩選培養(yǎng)基的組培瓶?中進(jìn)行伸長培養(yǎng)，培養(yǎng)2-4周，獲得表型趨于正常的芽；

(8)誘導(dǎo)生根及檢測：

取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉(zhuǎn)入RM培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進(jìn)行全基因組PCR檢測，驗(yàn)證農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化了的雜交楊樹。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(1)中所述M1′培養(yǎng)基的組成為：MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA?1.86mg，細(xì)胞分裂素2ip1.02mg，pH＝5.6-5.8，瓊脂7-7.2g，加水至1L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(2)中所述農(nóng)桿菌為C58/pMP90/pH7GWIWG2(I)，所述抗生素為：利福平、慶大霉素和壯觀霉素，在YEB固體培養(yǎng)基或YEB液體培養(yǎng)基中利福平的濃度為25-50mg/L、慶大霉素的濃度為20-30mg/L、壯觀霉素的濃度為30-50mg/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雜交楊樹的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(3)中所述M液的組成為：MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA?1.86mg，細(xì)胞分裂素2ip?1.02mg，pH＝5.6-5.8，乙酰丁香酮19.86mg，加水至1L。