[發明專利]一種甜菜堿合成途徑中的甲基轉移酶基因及其利用

無效

• 申請號: 201210104875.7
• 申請日: 2009-09-09
• 公開（公告）號: CN102604988A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 張舉仁;何影;李坤朋;何春梅
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H1/02;A01H5/00
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 王緒銀

本申請是公開號CN?101805744A申請的分案申請，原申請的申請日：2009.09.09，申請號：200910018647.6，發明名稱：一種甜菜堿合成途徑中的甲基轉移酶基因及其修飾和利用。?

技術領域

本發明公開一種藍細菌甘氨酸甜菜堿合成途徑中的兩種甲基轉移酶基因序列以及其修飾基因的序列和它們分別編碼的蛋白質序列，并將這兩種基因用于作物抗逆育種，屬于基因工程領域。具體地說涉及到克隆和修飾參與一條甘氨酸甜菜堿生物合成途徑中的甘氨酸肌氨酸N-甲基轉移酶基因和二甲基甘氨酸N-甲基轉移酶基因及利用。?

背景技術

在甜菜堿天然合成植物中，甘氨酸甜菜堿作為一種滲透保護物質，能夠提高植物對多種非生物脅迫(如鹽堿、干旱、低溫等)的抗性，而且對某一脅迫的抗性程度與甜菜堿的積累水平密切相關?；蚬こ萄芯勘砻鳎ㄟ^轉基因技術在植物中積累甘氨酸甜菜堿能夠提高其抗逆性。?

在自然界中，已知的甘氨酸甜菜堿的生物合成途徑主要有兩種，即膽堿氧化途徑和甘氨酸甲基化途徑。?

膽堿氧化途徑以膽堿為底物，通過一步或兩步氧化反應合成甘氨酸甜菜堿。此途徑分布廣泛，由存在于微生物、植物和哺乳動物中的膽堿脫氫酶(CDH)和甜菜堿醛脫氫酶催化。存在于微生物中的膽堿氧化酶，能催化合成甜菜堿的兩個連續的反應。在合成甘氨酸甜菜堿的高等植物中膽堿單加氧酶和甜菜堿醛脫氫酶依次催化甘氨酸甜菜堿合成。已有多個參與膽堿氧化合成甘氨酸甜菜堿的酶基因被相繼克隆。?

甘氨酸甲基化途徑是甘氨酸經過連續三步N-甲基化生成甜菜堿，是由依賴S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甘氨酸肌氨酸甲基轉移酶(glycine?sarcosine?methyltransferase，GSMT)和依賴SAM的肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉移酶(sarcosine?dimethylglycine?methyltransferase，SDMT)分別催化完成的。從上個世紀80年代后期開始，陸續在一些古細菌、真細菌和極端蘭細菌中發現了該條途徑，但了解極少，至今只從少數幾個物種中克隆得到相關基因。?

以膽堿為底物的合成途徑已在多種生物中進行了研究。該途徑中根據膽堿氧化方式的不同涉及一種或兩種酶。在高等植物中，甜菜堿生物合成途徑的研究主要集中于藜科植物，在莧科和禾本科植物中也有研究(McNeil?et?al.，1999，2001)。在藜科和莧科植物中，甜菜堿由膽堿經兩步氧化反應合成，先由膽堿單加氧酶(CMO)催化生成甜菜堿醛，后者在甜菜堿醛脫氫酶(BADH)催化下生成甜菜堿(Weretilnyk?et?al.，1989；Akamoto，2000)。目前，CMO僅在藜科和莧科植物中發現，推測其它科植物可能具有不同的膽堿氧化酶。而編碼BADH的基因已經從菠菜(Weretilnyk?and?Hanson，1990)等多種植物中克隆。BADH并不是甘氨酸甜菜堿合成特用的酶，它與ω-氨基醛脫氫酶(一種在多胺代謝中廣泛存在的酶)相同(?et?al.，1994；Rathinasabapathi?et?al.，1994)。?

在大腸桿菌中，與甜菜堿合成相關基因由bet操縱子編碼(Andresen?et?al.，1988；Lamark?et?al.，1991)：betA編碼CDH，betB編碼BADH，betT編碼膽堿轉運蛋白，betI編碼調控蛋白，從膽堿到甜菜堿的轉變途徑與植物中類似，是由兩種酶催化的，即膽堿脫氫酶(choline?dehydrogenase，CDH)和BADH。CDH是一種依賴氧的膜結合黃素蛋白，不但能催化膽堿氧化為甜菜堿醛，而且能以幾乎相同的速率催化甜菜堿醛的氧化。BADH是一種依賴于NAD的可溶性蛋白，對甜菜堿醛具有很高的親合性(Landfald?and?Strom，?1986)。?

在微生物球形節桿菌(Arthrobacter?globiformis)和滋養節桿菌(A.pascens)中，甘氨酸甜菜堿的合成僅需要一種酶即膽堿氧化酶(choline?oxidase，COD)催化(Ikuta?et?al.，1977)，同時產生H₂O₂。?