[發(fā)明專利]基于ANT1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210104416.9
• 申請日: 2012-04-11
• 公開（公告）號: CN102657875A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋耀明;黃嵐;耿召華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K38/45;A61K9/127;A61P9/00;A61P9/10;C12N15/79;C12N15/54
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種靶向型免疫脂質(zhì)體，還涉及該免疫脂質(zhì)體的制備方法和在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

冠狀動脈內(nèi)支架植入術(shù)（PCI）及經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈形成術(shù)（PTCA）后，最主要的并發(fā)癥是術(shù)后6?個月內(nèi)30%-50%發(fā)生再狹窄，表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞（vascular?smooth?muscle?cells，VSMC）密度增加和新生內(nèi)膜增厚，VSMC凋亡不足是再狹窄發(fā)生的機(jī)制之一。研究表明，增加VSMC的凋亡可以防治再狹窄。因此，針對VSMC凋亡方面的研究成為治療再狹窄的熱點領(lǐng)域。

腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶（adenine?nucleotide?translocase，ANT）是位于線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白，參與由線粒體經(jīng)內(nèi)膜到胞質(zhì)轉(zhuǎn)運氧化磷酸化過程中的ATP?和ADP，與細(xì)胞內(nèi)的能量代謝密切相關(guān)。此外，ANT還參與線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換（mitochondrial?permeability?transition，MPT），從而與細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密，但其作用與能量轉(zhuǎn)運無關(guān)。ANT有4?種異構(gòu)體，其中ANT1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng)，但其是否能誘導(dǎo)VSMC凋亡國內(nèi)外尚未見報道。

細(xì)胞骨架是VSMC保持特定細(xì)胞形態(tài)和行使收縮功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。平滑肌SM22α（smooth?muscle?22?alpha）蛋白又稱轉(zhuǎn)凝蛋白（transgelin），是一種重要的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，在分化型VSMC中大量表達(dá)，可通過與肌動蛋白（actin）相互作用參與細(xì)胞骨架重構(gòu)和表型調(diào)節(jié)。此外，SM22α?還可作為信號分子參與VSMC的生長和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。因此，SM22α在VSMC表型轉(zhuǎn)化和血管重塑性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益成為人們關(guān)注的焦點。

脂質(zhì)體是由一層或多層同心的脂質(zhì)雙分子膜包封而成的球狀體，可以包裹多種物質(zhì)（如藥物、核酸等）并將其轉(zhuǎn)入多種類型的細(xì)胞中，具有延長包裹物的作用時間、增加細(xì)胞對包裹物的攝取量、提高療效、減少毒副作用等特點，但其缺乏主動靶向性。免疫脂質(zhì)體是一種表面結(jié)合有抗體或抗體片段等物質(zhì)的脂質(zhì)體，其借助抗體或抗體片段與靶細(xì)胞表面抗原的特異性結(jié)合，可以特異性識別并結(jié)合靶細(xì)胞，使脂質(zhì)體在靶區(qū)釋放包裹物，從而實現(xiàn)主動靶向功能。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于ANT1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體，可以主動靶向VSMC，在細(xì)胞中表達(dá)ANT1，誘導(dǎo)VSMC凋亡并抑制其增殖，從而發(fā)揮抗血管狹窄的作用；目的之二在于提供所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體的制備方法，操作簡便易行；目的之三在于提供所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、基于ANT1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體，在內(nèi)部包封有ANT1重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體表面結(jié)合有抗SM22α單克隆抗體，所述ANT1重組真核表達(dá)載體中含有核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示的ANT1基因。

進(jìn)一步，所述ANT1重組真核表達(dá)載體是將ANT1基因插入真核表達(dá)載體p3xFLAG-?CMV-14的多克隆位點中而得到。

進(jìn)一步，所述脂質(zhì)體是以質(zhì)量比為5:1的卵磷脂和膽固醇為原料制得。

2、所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟：

a、ANT1重組真核表達(dá)載體的制備：將核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示的ANT1基因插入真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14的多克隆位點中，制得ANT1重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-?CMV-14/ANT1；

b、ANT1重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體包封：將卵磷脂和膽固醇溶解于乙醚中，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲，再加入p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，在干冰和42℃水浴中反復(fù)凍融并通過孔徑為100nm的薄膜擠出器，用核酸酶Dnase?I和exonuclease?III降解未包封入脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14/ANT1，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去被核酸酶降解的p3xFLAG-?CMV-14/ANT1，即制得包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂質(zhì)體；

c、包封有ANT1重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗SM22α單克隆抗體的連接：將抗SM22α單克隆抗體經(jīng)巰基化修飾后，與包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂質(zhì)體在室溫下振搖連接過夜，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去未連接的抗SM22α單克隆抗體，即得基于ANT1基因的靶向型免疫脂質(zhì)體。