[發明專利]細粒棘球蚴EG95蛋白的修飾及在酵母中的表達

有效

• 申請號: 201210103512.1
• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN102731641A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 賈萬忠;婁忠子;李宏民;閆鴻斌;倪興維
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;C12P21/02;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/84
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

1.細粒棘球蚴主要免疫原性蛋白EG95的修飾方法，其特征在于在完整EG95蛋白的基礎上，N-端去除23個氨基酸，C-端截去22個氨基酸，改造后的tEG95基因序列為SEQ№1，蛋白質序列為SEQ?№2。

2.權利要求1所述的經修飾細粒棘球蚴主要免疫原性蛋白tEG95制備重組表達質粒的方法，將權利要求1所述的改造后的tEG95通過TA克隆到pMD18T-Simple載體上，構建pMD18T-tEG95重組載體，再將重組pMD18T-tEG95載體和pPIC9K進行EcoR?I和Not?I雙酶切，然后再用T4DNA連接酶將tEG95基因片段和pPIC9K載體進行連接，構建成含有α-Factor信號肽的酵母表達載體pPIC9K-tEG95。

3.用權利要求2所述的重組質粒構建重組酵母工程菌的方法，其特征是將權利要求2所述的酵母表達載體pPIC9K-tEG95經Sal?I酶切，然后采用1500V，200，25μF電擊5ms，將酶切產物轉化畢赤酵母GS115，轉化液涂布MD平板，然后轉接含有1mg/mL的YPD平板上培養，后轉至含2mg/mL?YPD平板獲得抗性菌株，將抗性菌轉接含2mg/mL?YPD液體培養基，96孔細胞培養板上進行有限稀釋獲取抗性酵母工程菌單克隆。

4.用權利要求3所述的方法構建并篩選出酵母單克隆菌株EG95-1，該菌株于2012年02月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No5764。

5.權利要求4所述的菌株誘導表達方法，其特征在于將重組工程菌株EG95-1接種于15mL?BMGY液體培養基中，28℃培養24h左右，當OD600＝5～6時，室溫1500r/min離心5min收獲細胞，將收獲的細胞用20mL?BMMY培養基懸浮于250mL的三角瓶中，無菌培養容器透氣封口膜扎口，28℃誘導表達，每24h向培養基中補加甲醇至終濃度為0.5％～1％左右，以保證持續的誘導表達。

6.對抗性酵母工程菌EG95-1進行PCR鑒定所用的擴增引物序列為SEQ№2和SEQ№3。