[發明專利]在大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法

無效

• 申請號: 201210103493.2
• 申請日: 2012-04-11
• 公開（公告）號: CN102643849A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 徐志南;潘劍峰;黃磊;蔡謹
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/245;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

1.一種大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，它包括以下步驟：

（1）大腸桿菌水通道蛋白AqpZ-HIS的擴增：根據NCBI上的大腸桿菌水通道蛋白基因序列設計2對引物，通過設計引物在AqpZ基因的3'端人為的添加8個HIS親和標簽，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；根據pMAL-p2和pMAL-c5e這兩個載體的多克隆位點特點，在第一引物的上下游分別加上Bam?HI和Sal?I限制性內切酶位點以適用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分別加上Bam?HI和Hind?III限制性內切酶位點以適用于pMAL-c5e，利用聚合酶鏈式反應，得到帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA

（2）重組表達載體的構建：將步驟1得到的帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同樣的內切酶雙酶切過的表達載體pMAL-p2和pMAL-c5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元標簽重組表達載體pMAL-p2-AqpZ-HIS及?pMAL-c5e-AqpZ-HIS；將這兩個二元標簽重組表達載體化到大腸桿菌DH5α感受態中，然后，涂布在含氨芐霉素的LB平板上，培養過夜，隨機挑取平板上生長的菌落，堿法抽提質粒DNA，進行雙酶切和測序鑒定；

（3）工程菌株的構建及誘導表達：將步驟2鑒定正確的的質粒轉化到大腸桿菌表達宿主Rosetta?(DE3)中，并接種到含有100?μg/mL?氨芐霉素和34?μg/mL?氯霉素的LB培養基中，在200-250轉/分鐘轉速、30℃下培養過夜，得到種子液；然后，把種子液接種到SOC培養基搖瓶中，種子液與SOC培養基的體積比為l:50，在200-250轉/分鐘轉速、30℃下培養至OD600為1.5時加入IPTG至IPTG的摩爾濃度為0.6?mM，并繼續誘導培養8小時，然后5000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體，即得到超表達水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體；

（4）超聲波破碎步驟3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體，12000轉/分鐘離心10分鐘后收集上清；

（5）純化步驟4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。

2.根據權利要求1所述大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，所述步驟（5）具體為：向上清中加入Triton?X100至Triton?X100的體積百分比濃度為4%，?室溫振蕩1小時，12000轉/分鐘離心30分鐘后收集上清；上清上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co²⁺-NTA親和層析柱后，再用平衡緩沖液平衡，沖洗，最后用洗脫液洗脫結合到Co²⁺-NTA親和層析柱上的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS；采用脫鹽柱G10將純化后的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的緩沖液置換到factor?Xa工作緩沖液或腸激酶工作緩沖液中，加入腸激酶或factor?Xa在20℃酶切10小時；將酶切徹底的反應液用平衡緩沖液十倍稀釋后，再次上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co²⁺-NTA親和層析柱，再平衡，沖洗最后用洗脫液洗脫結合到Co²⁺-NTA親和層析柱上的AqpZ-HIS，得到高純度的水通道蛋白AqpZ-HIS。

3.根據權利要求1所述大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，所述步驟（5）具體為：向上清中加入Triton?X100至Triton?X100的體積百分比濃度為4%，?室溫振蕩1小時，12000轉/分鐘離心30分鐘后收集上清；加入腸激酶在20℃酶切20小時；將酶切徹底的反應液用平衡緩沖液十倍稀釋后，上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co²⁺-NTA親和層析柱，再用平衡緩沖液平衡，沖洗，最后用洗脫液洗脫結合到Co²⁺-NTA親和層析柱上的AqpZ-HIS，得到高純度的水通道蛋白AqpZ-HIS。