[發明專利]胸腺素β4四聯體基因及其在大腸桿菌中表達的方法

無效

• 申請號: 201210102816.6
• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN102643826A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 趙凌俠;王曉磊;楊桂華;李善爽;高美鳳;趙攀峰;高蕾
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C07K14/575;C12N15/63;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

1.一種4×Tβ4基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種蛋白質，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.一種重組載體，包括目的基因和載體，其特征在于，所述目的基因的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述載體選自質粒、粘?；颚耸删w中的一種。

4.一種在大腸桿菌中表達4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，該方法包括如下的步驟：

步驟一，將含有權利要求1所述4×Tβ4基因的克隆載體質粒進行酶切，回收所述4×Tβ4基因的DNA片段，獲得帶有相應粘性末端的所述4×Tβ4基因，然后將所述帶有相應粘性末端的4×Tβ4基因克隆到原核表達載體中，通過測序或酶切鑒定確保所述表達載體中的所述4×Tβ4基因閱讀框架正確；

步驟二，將所述表達載體用熱激法轉化大腸桿菌中，獲得包含所述4×Tβ4基因表達載體的大腸桿菌工程菌；

步驟三，提取4×Tβ4功能蛋白。

5.根據權利要求4所述的在大腸桿菌中表達4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述轉化包括以下步驟：

步驟1，取剛剛用CaCl₂法制備的感受態細胞，或從-70℃冰箱中取出用CaCl₂法制備的感受態細胞于冰上融化10min；

步驟2，無菌條件下按照每200μL菌液加入100ng已純化的表達載體DNA，將5～10μL所述表達載體加入所述感受態細胞中，用加樣器輕輕混勻，放置冰上30min；

步驟3，42℃熱激90s，再放于冰上1～2min；

步驟4，加入800μL經過37℃預熱的含有卡那霉素100mg/L的LB液體培養基，37℃，180rpm復蘇培養90min；

步驟5，5000rpm離心5min，吸去上清900μL，將剩余的100μL菌液混勻；

步驟6，用涂布棒將所述菌液均勻涂于含有100mg/L的卡那霉素的LB固體平板上，37℃倒置16h～24h至長出菌落，用無菌牙簽從所述LB固體平板上挑取抗性菌落進行鑒定。

6.根據權利要求5所述的在大腸桿菌中表達4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，所述LB液體培養基的組分以及各組分的質量百分比為：酵母提取物為0.5％，胰蛋白胨為1％，氯化鈉為1％，余量為蒸餾水，該LB液體培養基的pH值為7.0。

7.根據權利要求5所述的在大腸桿菌中表達4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，所述LB固體培養基的組分以及各組分的質量百分比為：酵母提取物為0.5％，胰蛋白胨為1％，氯化鈉為1％，瓊脂粉1.5％，卡那霉素為0.01％，余量為蒸餾水，該LB固體培養基的pH值為7.0。

8.根據權利要求4所述的在腸桿菌中表達4×Tβ4功能蛋白的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述提取包括以下步驟：

4℃條件下，12000rpm離心5min收集經誘導表達所述4×Tβ4蛋白的菌體，棄上清，所述菌體一直保持在冰上；

按5∶1的比例用PBS溶解所述離心收集的菌體，超聲波破碎所述菌體，樣品一直保持在冰上，所述PBS的組分以及各組分濃度為：140mM?NaCl，2.7mM?KCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mM?KH₂PO₄；

重懸菌體沉淀，室溫攪拌15～60min，或者輕輕振蕩，至重懸溶液呈半透明狀；

4℃條件下，10000g離心30min，棄掉沉淀，收集上清液用于上柱純化；

懸浮于50％Ni-NTA溶液，裝柱，所述Ni-NTA用量為5-10mg蛋白/mL樹脂；

所述樹脂自然沉降后，用5倍柱體積的ddH₂O過柱清洗層析柱，再加入5-10倍柱體積的1×Ni-NTA?buffer?B平衡所述層析柱；

樣品上柱，用5-10倍柱體積的1×Ni-NTA?buffer?B洗柱，流速為1mL/min，收集流出液，進行SDS-PAGE檢測；

用5～10倍柱體積的1×Ni-NTA?buffer?C洗柱，收集流出液，進行SDS-PAGE檢測；

用5倍柱體積的1×Ni-NTAbufferE洗柱，對4×Tβ4蛋白進行洗脫，分別用2mL的EP管收集洗脫液，所述洗脫液保存于-20℃。