[發明專利]一株產D-乳酸動態調控重組菌及用其制備D-乳酸的方法

有效

• 申請號: 201210102731.8
• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN102618478A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 王正祥;周麗;田康明;沈微
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/56;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及微生物法高效制備D-乳酸的發酵工藝及其發酵生產菌種，尤其是一種能夠在工業化生產規模下，僅通過發酵工藝條件如溫度因素的簡單調控，實現D-乳酸高效合成和低成本發酵生產的工藝，屬于微生物基因工程、生物化工和微生物發酵工程技術領域。

背景技術

乳酸（α-羥基丙酸，分子式為C₂H₅OCOOH）是一種天然存在的有機酸，廣泛存在于人、動物、植物和微生物中。乳酸是世界上公認的三大有機酸之一，乳酸及其衍生物被廣泛應用于釀造、食品、農業、醫藥、化工、紡織、皮革、煙草、印染等行業中。乳酸是自然界最小的手性分子，其羧基α位碳原子為不對稱碳原子，具有L（＋）和D（－）兩種光學構型。異構體之一的D-乳酸是一種重要的手性中間體和聚乳酸合成的原料。隨著人們環保意識的提高，生物可降解聚乳酸材料的市場需求量劇增，也推動了對其單體D-乳酸的需求，同時促進了對以高產量、高轉化率和高生產強度生產D-乳酸合成方法的需求。

實現D-乳酸的快速高效合成需要兩個條件：一是菌體生長階段，消除各種不利因素對菌體活性的影響，獲得高活性的細胞工廠；二是D-乳酸合成階段，菌體不生長或緩慢生長，副產物不合成，細胞工廠處于高強度合成D-乳酸狀態。

已有的研究多是為了實現上述目標。但是采用的方式或者是添加乙酸等物質（Zhu?Y.?et?al.,?Applied?Environmental?Microbiology,?2007,?73:?456~464），或者是通入氮氣等維持厭氧條件的氣體（Zhu?Y.?et?al.,?Applied?Environmental?Microbiology,?2007,?73:?456~464）。而從工業化規模生產角度來講，前者在乙酸等物質的流加控制上實現難度大，后者則需要維持發酵體系的密閉性，從而增加了設備成本和維護成本。

本發明涉及的菌種可以通過環境條件的調整或改變，如：溫度的降低及提高；或營養物質添加或濃度變更，如：乳糖或其結構類似物向培養基的添加；或特殊營養物質的濃度變更，如：氧氣（空氣）的增減；或上述方法的組合，簡易實現微生物初級代謝產物，如D-乳酸的合成途徑的啟動/關閉，來實現培養環境條件更適合細胞生長或更適合微生物初級代謝產物，如D-乳酸的合成，且該過程對環境因素無特殊要求。可以在工業規模生產中，僅通過簡單的培養環境條件或因子，如溫度的變化，方便地實現菌體的快速生長和微生物初級代謝產物，如D-乳酸的不合成；而在微生物初級代謝產物，如D-乳酸的合成過程中，其它種類的有機分子副產物不合成。在這一過程中，微生物初級代謝產物，如D-乳酸的合成速度還得到了大幅度加強。更為有益的是，該工藝發酵生產D-乳酸的過程在乳酸合成階段對發酵體系的密閉性及無菌程度均無較高要求，甚至可以在開放環境中實現發酵生產。本發明涉及的發酵工藝和菌種，在微生物初級代謝產物如D-乳酸的工業化規模生產中意義顯著，推廣前景廣闊。

作為聚乳酸合成材料的單體，D-乳酸的光學純度和化學純度直接影響聚合材料的物理性能（Jem?K.J.?et?al.,?Microbiology?Monographs,?2010,?14:?323~346）。因此，獲得高光學純度和高化學純度的D-乳酸顯得尤為重要。

野生大腸桿菌即可發酵產生較高光學純度的D-乳酸（常在99%以上），且其生長速度快、營養需求簡單，但其化學純度不高（常在80%以下）。因此，重組大腸桿菌是生物合成乳酸的主要菌種。與乳酸細菌相比，重組大腸桿菌進行D-乳酸發酵生產的優越之處在于其對乳酸的轉化率常常可超過90%；更重要的是，作為基因操作的工具菌，大腸桿菌遺傳背景清楚、易于進行基因操作。通關定向遺傳改良，可以使大腸桿菌在合成乳酸時的光學純度和化學純度皆能達到理想的程度。