[發(fā)明專利]一種微流體自驅(qū)動原位壓印生物芯片新方法

無效

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• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN102628081A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李文;湯建新;鄧靖
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C40B50/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微流體自驅(qū)動原位合成壓印生物芯片新方法，屬于生物化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

基因芯片的制備技術(shù)主要有原位合成法和直接點樣法兩種。點樣法是指運用各種方法（打印、噴印等）將預(yù)先合成的DNA探針或cDNA探針固定到玻片或其它固體載片上形成微探針陣列。與原位合成法相比，點樣法較簡單，只需將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA等樣品通過自動點樣裝置點于經(jīng)特殊處理的玻璃片或其它材料上即可。點樣法又分為打印和噴印兩種方法：其中打印法的優(yōu)點是探針密度相對較高，通?？纱蛴?500個探針/cm²，缺點是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針容易堵塞，且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長，其缺點是噴印的斑點大，因此探針密度低，通常只有400位點/cm²。無論是采用打印或者噴印的方法，都需要事先大量地制備純化、量化、分類PCR產(chǎn)物。采用點樣法制備密度基因芯片的過程中，當(dāng)探針數(shù)量較大時，所需探針成本也隨著增加。例如，當(dāng)20目的探針數(shù)量達(dá)到1000條時，探針成本即在100，000元人民幣左右。因而當(dāng)探針數(shù)目較多時，這一技術(shù)無法與原位合成技術(shù)相比擬，此外還有各種客觀因素導(dǎo)致探針密度不均勻因而雜交信號不均勻的缺點。

原位合成是按照預(yù)先設(shè)計的堿基序列直接將探針合成在基片上，主要有光蝕刻原位合成和噴印原位合成兩種，目前只有美國Affymetrix公司擁有的光脫保護(hù)原位合成制備專利技術(shù)已實現(xiàn)基因芯片的規(guī)?；a(chǎn)，但該技術(shù)主要不足之處是特有的光脫保護(hù)方法需要制作一系列特定的光掩模，并且對不同的用戶需求和不同的基因芯片必須重新設(shè)計光掩，成本相當(dāng)高，不適合小批量需求；此外，光蝕刻法每步合成率較低，一般為95?%左右，合成30?nt產(chǎn)率僅20?%，還需要特殊的光脫保護(hù)試劑。

原位噴印合成技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此無需特殊制備的化學(xué)試劑，其原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個芯片上移動并根據(jù)芯片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。噴印法每步偶聯(lián)率達(dá)99?%以上，合成30?nt產(chǎn)率可達(dá)74?%，從這個意義上說噴印法特異性應(yīng)比光刻法高。此外，它并不需特殊的合成試劑。

國內(nèi)東南大學(xué)吳健雄實驗室經(jīng)過數(shù)年的努力，開發(fā)了分子印章接觸壓印DNA微陣列原位合成技術(shù)，完全采用現(xiàn)有最成熟的DNA合成路線，可望降低成本。但美中不足的是在掩模設(shè)計上和Affymetrix公司擁有的光脫保護(hù)原位合成制備專利技術(shù)一樣，針對不同的用戶需求和不同的基因芯片，必須重新設(shè)計掩模。

本發(fā)明提出和研究了活版印刷原位合成中低密度基因芯片新方法，可望避免現(xiàn)有原位合成方法中煩瑣而昂貴的掩模制備過程及點樣法中昂貴的探針修飾或標(biāo)記成本，針對不同用戶需求只需重新排列印刷模版即可，易實現(xiàn)自動控制和精確定位，合成速度快，在較短時間內(nèi)就可快速印刷合成出探針分布均勻的大批量基因芯片。但主要存在的缺陷就是模版的設(shè)計需要手動實現(xiàn)，過程繁瑣。尤其是當(dāng)芯片密度較高時，手動排版不僅所需時間長，而且非常容易出錯。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有生物芯片制備方法存在的缺陷和不足，提供一種微流體自驅(qū)動原位壓印合成生物芯片新方法。本發(fā)明采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，在原位合成時采用真空納米纖維管自動驅(qū)動堿基單體的自下而上傳輸，結(jié)合計算機(jī)技術(shù)控制載玻片進(jìn)行壓印。本發(fā)明依賴于自動化設(shè)備和裝置來實現(xiàn)芯片原位壓印合成，采用本發(fā)明所制備的生物芯片密度取決于纖維管直徑大小以及壓印頭的定位精度，在現(xiàn)有條件下探針密度可達(dá)400位點/cm²。

實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是：采用4根相同長度且具有微納米通道的纖維管作為微流體的自驅(qū)動裝置，四種堿基單體在纖維管的毛細(xì)效應(yīng)作用下從單體儲存池經(jīng)過微納米通道源源不斷地傳輸?shù)巾敹?，富足而不過量，用于生物芯片壓印。高定位精度的機(jī)械手抓取經(jīng)過處理的玻璃載片由上往下豎直壓印于纖維管頂端，堿基液就黏附于玻璃載片下表面，以相同方式控制玻璃載片在特定位置壓印于四根纖維管，在玻璃載片下表面壓印得到一層單體微陣列。載玻片經(jīng)過噴淋清洗、氧化、托保護(hù)反應(yīng)后，繼續(xù)壓印第二層。多個循環(huán)壓印之后，即可得到任意探針長度的生物芯片。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、采用本發(fā)明所述的技術(shù)制備生物芯片，避免了現(xiàn)有原位合成方法中煩瑣而昂貴的掩模制作過程以及點樣法中探針的修飾和標(biāo)記成本。