[發(fā)明專利]一種利用愈傷組織再生途徑快速繁殖黃檗的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210099444.6
• 申請(qǐng)日: 2012-04-06
• 公開（公告）號(hào): CN102613084A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王慧梅;王文杰;陳亞杰;于海娣;祖元?jiǎng)?/a>
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北林業(yè)大學(xué);王慧梅
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明是一種通過(guò)愈傷組織再生途徑快速繁殖黃檗的方法，操作簡(jiǎn)單且周期短，不定芽再生頻率高，繁殖速度快。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

黃檗(Phellodendron?amurense?Rupr.)屬蕓香科(Rutaceae)黃檗屬，是我國(guó)東北地區(qū)三大珍貴闊葉樹種，是重要的藥用植物和用材樹種，為第三世紀(jì)古熱帶區(qū)系孑遺植物，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)漸危種(范繼紅，2006)。黃檗體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物小檗堿是傳統(tǒng)中藥黃連的主要有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、提高免疫力等功效。黃檗的木材可用來(lái)制作家具和工藝品，而且是工業(yè)用軟木塞和黃色染料的來(lái)源。黃檗的商業(yè)開發(fā)和傳統(tǒng)的無(wú)性繁殖由于黃檗種子育性差，較低的萌發(fā)率和扦插繁殖較差的生根能力而受到限制(Mukai?and?Yokoyama，1985)，而組織培養(yǎng)能夠有效地解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)愈傷組織再生途徑大量繁殖黃檗是藥用植物快速增殖的有效途徑(Castillo?and?Jordan，1997)。

目前在黃檗的組織培養(yǎng)方面研究相對(duì)較少，采用黃檗的種子為外植體(趙波，東北林業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007)已見(jiàn)研究報(bào)道，但采用種子為外植體處理起來(lái)比較麻煩，因?yàn)槊看瓮庵搀w都需要滅菌處理，如果滅菌不徹底，容易引發(fā)外植體大批污染。而本發(fā)明以黃檗無(wú)菌苗莖段為外植體，外植體取材容易且比較方便，操作簡(jiǎn)單，再生周期短，能夠在短期內(nèi)獲得大量的再生苗木，為黃檗的快速繁殖和利用基因工程育種打下很好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種更簡(jiǎn)單高效、操作方便地以黃檗無(wú)菌苗莖段為外植體通過(guò)愈傷組織再生途徑快速繁殖黃檗的方法，為解決黃檗資源緊缺提供大量?jī)?yōu)質(zhì)資源，該發(fā)明為黃檗分子育種及規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明主要是涉及利用黃檗無(wú)菌苗莖段為外植體，通過(guò)愈傷組織再生途徑獲得無(wú)菌苗的方法，主要包括外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，培養(yǎng)基組成，碳源種類及組成等。提供了利用黃檗無(wú)菌苗莖段為外植體，利用愈傷組織再生途徑，建立快速高效的黃檗莖段離體再生系統(tǒng)。

具體技術(shù)路線包括以下幾方面內(nèi)容：

1、黃檗無(wú)菌苗獲得：

材料來(lái)源于東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)黃檗休眠芽，取休眠芽，經(jīng)常規(guī)方法滅菌以后，將休眠芽接種在MS+BA1.0mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/l的培養(yǎng)基上。約一個(gè)半月左右可獲得黃檗的無(wú)菌苗。

2、黃檗莖段愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽再生

將黃檗莖段培養(yǎng)在含有不同BA和NAA的MS培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)最佳的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/l+NAA0.5mg/l+葡萄糖20g/l+瓊脂6.0g/l，不定芽的再生頻率為75.4％，平均出芽數(shù)為14.7。

3、不定芽的繼代增殖和擴(kuò)繁

將獲得的不定芽轉(zhuǎn)移到繼代增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/l上，獲得的不定芽仍保持較高的增殖系數(shù)，平均每個(gè)月的增殖系數(shù)為3.4。

4、不定芽的生根和移栽

將不定芽培養(yǎng)在生根培養(yǎng)基1/4MS+IBA0.8mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/l的培養(yǎng)基上，半個(gè)月左右開始有不定根出現(xiàn)，約3周左右，對(duì)生根的不定苗進(jìn)行移栽，移栽的基質(zhì)為沙子和泥炭土1∶1，移栽成活率為100％。

本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基都是按照常規(guī)的方法處理的，pH值均為5.8，高溫高壓(121℃，1.5個(gè)大氣壓)15min后使用的。

本發(fā)明的培養(yǎng)室是在常規(guī)的組織培養(yǎng)室(溫度25℃左右，光照1000～1500lux，光/暗周期16h/8h，濕度70％左右)中進(jìn)行的。

本發(fā)明的技術(shù)特征：.

1)適合黃檗莖段愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽再生的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)為BA1.5mg/l和NAA0.5mg/l。

2)適合黃檗莖段愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽再生的最佳碳源為葡萄糖20g/l。

3)適合黃檗不定芽繼代增殖的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)為BA0.5mg/l。

4)外植體容易獲得，操作簡(jiǎn)單。

5)移栽成活率高。

6)可以源源不斷地獲得黃檗的再生苗。

具體實(shí)施方式：

實(shí)例1黃檗莖段愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽再生

1)材料來(lái)源

材料來(lái)源于黃檗無(wú)菌苗的莖段。

2)黃檗無(wú)菌苗的獲得