[發明專利]大腸桿菌工程菌及其生產軟骨素的方法

無效

• 申請號: 201210098057.0
• 申請日: 2012-04-06
• 公開（公告）號: CN102618597A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 劉立明;吳秋林;楊愛華;劉杰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12N15/31;C12N1/21;C12N15/63;C07K14/245;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及高產軟骨素的基因工程菌及其構建方法，屬于基因工程領域。涉及生產軟骨素的方法，屬于發酵工程領域。

背景技術

軟骨素(Chondroitin，Ch)是未硫酸化的硫酸軟骨素(Chondroitin?Sulfate，CS)，是由葡糖醛酸(D-GlcUA)與N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接而成的多糖。可在其活性位點硫酸化形成硫酸軟骨素。目前，硫酸軟骨素的工業化生產是以動物軟骨為原料，通過提取法生產硫酸軟骨素。然而，由于原料來源有限(動物軟骨的生產周期較長)、產業水平不高(工藝繁瑣、收率不高、質量不穩)、產品質量不高(采用γ射線殺菌導致輻射殘留)、污染嚴重(產生大量的有機物和蛋白廢水)等產業瓶頸，嚴重制約了硫酸軟骨素提取產業的發展。目前已經研究了利用微生物發酵法生產硫酸軟骨素。

已知某些微生物能合成硫酸軟骨素類似物作為其莢膜多糖。如，1996年Manzoni首次報道以E.coli?K4為生產菌株，進行發酵生產果糖軟骨素，而USP?6777398?B2公開了利用K4莢膜多糖制備硫酸軟骨素的方法。此外，WO?0102597，USP?20100151532A1，WO?2010136435A1公開了大腸桿菌K4發酵生產軟骨素的發酵工藝。同時近幾年對大腸桿菌莢膜多糖的合成途徑，以及SlyA蛋白等轉錄調控因子的轉錄調控機制有了進一步的研究(Advanced?in?Applied?Microbiology，2008，65：1-26；Journal?ofBiological?Chemistry，2007，282(46)：33326-33335)。但由于微生物自身代謝的經濟學本能和工業生產環境與自然環境的巨大差異，導致軟骨素的產量、產率和生產強度較低，成為制約發酵法生產硫酸軟骨素工業化的關鍵瓶頸。

發明內容

本發明的目的是提供一株高產軟骨素的大腸桿菌工程菌，以及應用該工程菌生產軟骨素的方法。

本發明的發明人對大腸桿菌K4莢膜多糖合成途徑的調控機制進行了深入的研究，發現SlyA蛋白是莢膜多糖合成途徑的正調控因子，其過量表達能增強莢膜多糖合成基因簇啟動子的轉錄活性，高效合成莢膜多糖，因此完成了本發明。

本發明的目的1是提供導入了編碼SlyA蛋白的基因工程序列并且具有高效生產軟骨素的能力的大腸桿菌工程菌。

在本文中，所述的編碼SlyA蛋白的基因工程序列優選為編碼選自由以下(A)和(B)所組成的組的DNA：

(A)包含SEQ?ID?NO：1的核苷酸序列的DNA；和

(B)包含與SEQ?ID?NO：1的核苷酸序列的同一性在90％以上，并編碼具有SlyA蛋白轉錄調控活性的蛋白的DNA。

所述的SlyA蛋白選自由以下(a)和(b)所組成的組的蛋白質：

(a)包含SEQ?ID?NO：2氨基酸序列的蛋白質；以及

(b)包含與SEQ?ID?NO：2氨基酸序列的的同一性在95％以上，并具有SlyA蛋白轉錄調控活性。

所述編碼SlyA蛋白的基因工程序列優選來源于為大腸桿菌K4，包括ATCC?23502(American?Type?Culture?Collection-USA)，Bi?8337/41(International?Escherichia?Centre-Denmark)，NCTC?9005(Nationa?Collection?of?Type?Cultures-UK)，U?1-412616(Freiburg?collection)。

本發明的目的2是提供生產軟骨素的方法，其至少包括以下步驟

(1)培養如上所述的大腸桿菌工程菌；

(2)從該培養物中收集莢膜多糖；

(3)將收集到的莢膜多糖進行脫果糖處理，得到軟骨素。

本發明的目的3是提供包含插入編碼slyA蛋白的基因工程序列的表達載體。

附圖說明

圖1是表達SlyA基因的重組載體的結構圖。

圖2是重組載體的酶切圖譜。泳道1為Bam?HI和Hind?III雙酶切為441?bp和4414?bp兩條帶，泳道2和3為重組質粒，M為分子量標記。

圖3是SlyA的表達圖譜。泳道1為未加IPTG誘導的大腸桿菌工程菌，泳道2為加入IPTG誘導的大腸桿菌重組菌，泳道3為導入pTrcHisA的大腸桿菌，泳道4為大腸桿菌K4原菌，M為分子量標記。