[發(fā)明專利]二化螟魚尼丁受體基因CsRyR及其編碼的蛋白和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210097943.1
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102628049A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃佳;吳順凡;葉恭銀
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/705;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/19;C12Q1/02
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及農(nóng)藥學(xué)領(lǐng)域，主要是一種在二化螟中表達(dá)的魚尼丁受體基因(核酸序列)及其編碼蛋白。本發(fā)明還涉及該蛋白和受體基因(核酸序列)的制備方法和用途。

背景技術(shù)

魚尼丁受體(RyR)的命名來自于從南美的一種大風(fēng)子科的豆科植物Ryania?speciosa中分離出來的植物堿殺蟲劑魚尼丁(ryanodine)。研究證明，魚尼丁是通過作用于RyR而產(chǎn)生殺蟲效果的(Fill?and?Copello，2002)。但由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難于改造，成本高和毒性高等因素，因而限制了其作為殺蟲劑的使用。經(jīng)過長期研究，日本農(nóng)藥終于(Nihon?Nohyaku)發(fā)現(xiàn)了鄰苯二甲酰胺類化合物(phthalic?diamides)的殺蟲活性，并從中商品化了氟蟲酰胺(Tohnishi?et?al.，2005)。幾乎同時美國杜邦對也該類化合物做了較大結(jié)構(gòu)改變和修飾，發(fā)現(xiàn)了一類新的鄰甲酰氨基苯甲酰胺類(anthranilic?diamides)殺蟲劑，并從中商品化了氯蟲酰胺(Lahm?et?al.，2005)。該化合物不僅在結(jié)構(gòu)上與氟蟲酰胺相似，即都具有二酰胺基元，故稱它們?yōu)槎０奉悮⑾x劑，而且都作用于RyR。這類殺蟲劑是一類對鱗翅目等害蟲高效，對哺乳動物低毒、安全，作用機(jī)理獨特，無交互抗性和對環(huán)境友好的新型殺蟲劑。在農(nóng)藥發(fā)展史上，該類殺蟲劑是繼以吡蟲啉為代表的新煙堿類殺蟲劑后的又一個新的突破(Nauen，2006)。所以目前包括杜邦、拜耳等在內(nèi)的農(nóng)化巨頭們正在繼續(xù)加緊開發(fā)二酰胺類殺蟲劑，同時試圖篩選更多作用于RyR的新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)的殺蟲活性物質(zhì)(Lahm?et?al.，2009)。

細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺濃度的改變是細(xì)胞生理功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，它的變化是Ca²⁺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放、攝取Ca²⁺等動態(tài)平衡的結(jié)果。RyR和三磷酸肌醇受體(IP₃R)(Berridge，1993)共同組成了兩類主要的位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)(SR/ER)上的調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+的通道蛋白(Berridge?et?al.，2000)。哺乳動物體內(nèi)共有三種不同基因編碼的RyR：RyR1主要在骨骼肌中表達(dá)，參與骨骼肌的興奮-收縮，中樞神經(jīng)中也有少量表達(dá)；RyR2主要表達(dá)于心肌中，是心肌收縮偶聯(lián)不可或缺的成分；RyR3表達(dá)于一些特定的肌肉及非肌肉組織中，包括腦、神經(jīng)等組織。RyR由4個分子量約為560kD的相同亞單位組成，是分子量很大的膜蛋白，包含了大量伸入胞漿的決定其特性的N末端結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域分布著通道調(diào)節(jié)物的結(jié)合位點(Fill?and?Copello，2002)。

雖然人們很早就通過生理生化等方法等發(fā)現(xiàn)昆蟲的肌肉細(xì)胞中存在著大量的RyR位點(Vazquez-Martinez?et?al.，2003)，但是相對于哺乳動物RyR較為系統(tǒng)完整的研究，昆蟲RyR分子水平的研究在很長時間內(nèi)幾乎是一篇空白，只有果蠅(Drosophila?melanogaster)的RyR基因全長cDNA被克隆(Takeshima?et?al.，1994)并且進(jìn)行了通道動力學(xué)的研究(Xu?et?al.，2000)。隨著二酰胺類殺蟲劑的發(fā)現(xiàn)和上市，昆蟲RyR也逐漸成為研究熱點。杜邦公司在Sf9細(xì)胞系中對不同種屬昆蟲的功能性RyR的全長基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)并申請了專利(WO2004027042)，這些昆蟲包括鱗翅目煙芽夜蛾(Heliothis?virescens)、同翅目桃蚜(Myzus?persicae)、棉蚜(Aphis?gossypii)和玉米飛虱(Peregrinus?maidis)。京都大學(xué)和日本農(nóng)藥公司克隆了家蠶(Bombyx?mori)的RyR基因并且成功在HEK293細(xì)胞系獲得穩(wěn)定高效表達(dá)(WO2007094408)。這些被注冊專利的基因序列具有廣泛的用途，如可用于大量化合物殺蟲活性篩選方法的建立，用于該受體蛋白抗體的制備，用于生物農(nóng)藥的開發(fā)以及用于轉(zhuǎn)基因作物研究等。

參考文獻(xiàn)具體如下：

1、Berridge?MJ.1993.Inositol?trisphosphate?and?calcium?signalling.Nature?361：315-325(磷酸肌醇和鈣信號，《自然》)。