[發明專利]一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201210097774.1
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102627692A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發明（設計）人: 肖磊;莊慶剛
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/63;C12N5/10;C12N15/85;C12R1/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用。

背景技術

按照人類的意愿對基因組進行定向靶向修飾一直是許多科學家的夢想。在內源的基因組上特異地刪除或加入我們需要的序列，一方面可以構建出各種動物模型用于生物學基礎研究和疾病機理研究，另一方面可以生產動物反應器用以廉價生產我們需要的又很難從其他途徑得到的生物組分。

朊蛋白類疾病，也叫傳染性海綿狀腦病，是一類致命的傳染性中樞神經系統退行性疾病，主要包括：發生在綿羊和山羊的羊搔癢病，發生在牛的牛海綿狀腦病(即瘋牛病)，以及發生在人的克雅氏病(CJD)、G綜合癥、致死性家族失眠癥(FFI)等。動物基因組編碼的朊蛋白(prpC，一種錨定在神經細胞、淋巴細胞和別的細胞外表面的膜糖蛋白)是一種與傳染性海綿狀腦病的發生直接相關的分子。雖然已有實驗證明缺失prpC的小鼠不僅能夠正常發育和繁殖后代并且具有抵抗傳染性海綿狀腦病的能力，然而缺失prpC的大型動物，尤其是那些在自然條件下可以自發感染該類疾病的大型動物，目前的研究距離實用性差距仍然很遠。

2001年英國的科學家使用綿羊胎兒成纖維細胞基因打靶再通過體細胞克隆獲得了四只Prnp+/-的羊羔，但其中三只都在出生后死亡，存活最久的也僅僅在世12天。2004年Kuroiwa等使用胎牛成纖維細胞敲除了牛編碼PrP的基因。2006年，Golding?MC等利用RNAi干涉技術針對引起牛瘋牛病和羊搔癢病的PRNP基因序列設計有效的siRNA，獲得一頭轉基因羊胎兒，對其檢測發現siRNA很好地抑制了體內PRNP基因的表達。我國科學家也致力于羊瘙癢癥的研究，成國祥等獲得了5只成活的Prnp+/-山羊。此后，他們將Prnp+/-的成年山羊體細胞進行二次基因打靶，將獲得的Prnp-/-體細胞進行克隆，但僅僅獲得了孕73天的Prnp-/-山羊胎兒，未得到成活的轉基因羊。從中我們可以推測Prnp+/-山羊的繁育情況并不容樂觀，二次基因打靶加再次的體細胞克隆的難度遠遠大于Prnp+/-山羊的自然交配獲得純合體。目前為止，雖然國內外的科學家們付出了艱苦的努力，但仍未獲得Prnp-/-的成年羊。此外，綿羊和山羊雖然都可能得羊瘙癢癥，但該病是主要發生于綿羊中的，而綿羊與山羊是同科而不同屬的動物，綿羊和山羊之間不能交配產羔，因此獲得PRNP基因敲除的綿羊是具有重要的科學和經濟價值的。

但人們一直沒有找到簡單高效的方法對基因組進行基因組靶向修飾。傳統的基因打靶技術依賴于細胞內自然發生的同源染色體隨機交換，其打靶效率非常低，通常只有10^-6-10^-8，這種打靶方法只在小鼠中得到了廣泛了應用，而在其他模式動物及大型哺乳動物中都因效率太低而得不到廣泛應用。

近年發展很快的序列特異的核酸酶可以用于精確的基因組靶向修飾。一般由序列特異的核酸酶由一個DNA識別結構域和一個非特異性核酸內切酶結構域構成。原理是首先由DNA識別域把核酸酶定位到需要編輯的基因組區域，然后非特異性核酸內切酶切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂(double-strand?break，DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修復可以引起基因的突變和促進該位點DNA同源重組。鋅指核酸酶(Zinc-finger?nucleases，ZFN)是現在研究最清楚也是應用最廣的序列特異的核酸酶。其原理是兩個鋅指蛋白特異識別兩段相隔5-7bp的DNA序列，并把與之融合表達的非特異性DNA切割蛋白Fok1的兩個單聚體定位到了一起，DNA切割蛋白形成雙聚體時可以切斷該位置的雙鏈DNA，從而造成DSB。ZFN的出現使基因組靶向修飾技術向前邁進了一大步，然而，ZFN技術還存在靶向不確定性、效率低、拖把率高等問題，研究者很難自行設計出特異和高效的靶向基因組目的序列的鋅指核酸酶仍然是制約ZFN廣泛應用的瓶頸。而商業購買高效特異的鋅指核酸酶又價格昂貴(20萬人民幣/基因)，一般研究者或商業公司根本無法承受這筆費用。

2009年兩個研究組發現植物病原體Xanthomonas中的一種可以調節植物基因表達的轉錄激活子樣效應因子(transcription?activator-like?effector，TALE)表現出DNA結合特異性，而其識別密碼具有模塊化和簡單化的特點，為科學家們開發出更簡易的新型基因組靶向修飾技術帶來了新希望。