[發明專利]一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法

有效

• 申請號: 201210097505.5
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102612966A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 盛春玲;高江云;范旭麗;林華
• 申請（專利權）人: 中國科學院西雙版納熱帶植物園
• 主分類號: A01G1/00
• 分類號: A01G1/00;A01C1/04;A01H4/00
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙) 53108
• 代理人: 謝嘉

技術領域

本發明涉及獲得蘭科植物種子萌發有效共生真菌的方法，具體來說涉及一種在兜唇石斛(Dendrobium?aphyllum)原生地誘導種子萌發，獲得原球莖，再從原球莖中分離、培養和篩選出對種子萌發有效共生真菌的方法。

背景技術

蘭科植物的種子非常細小，僅有發育不完全的胚，在自然條件下種子萌發需要依靠特定的共生真菌來獲取營養物質。目前蘭科植物種子的萌發，多采用人工培養基在無菌條件下進行非共生萌發，萌發率雖高，但在進行瀕危種類野外回歸時，幼苗移植到自然環境中存活率較低，并且由于無法與自然界中的真菌建立共生關系從而導致后續生長嚴重受限。通過種子和其有效萌發真菌在自然條件下的共生萌發能很好的解決這一問題。有效真菌的獲得目前多采用從蘭科植物野生植株的根中分離。但由于蘭科植物根中存在著大量作用未知的內生真菌，這使得種子萌發有效真菌的篩選和分離變得復雜而繁瑣。同時，不同蘭科植物根中的真菌與種子萌發階段的有效共生真菌是否相同目前仍不確定。因此，獲得種子萌發的有效共生真菌是開展珍稀瀕危蘭科植物回歸的關鍵環節。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，為實現兜唇石斛的野外回歸創造條件。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現。

除非另有說明，本發明所采用的百分數均為重量百分數。

本發明的技術方案主要是基于以下認識。

我們將兜唇石斛的種子放入特制的種子袋中，并將種子袋放置在有兜唇石斛植株生長的原生地，誘導種子萌發產生原球莖，將獲得的原球莖表面滅菌后在無菌條件下用人工培養基培養，誘導原球莖中的內生真菌生長，待長出菌絲時，進行真菌的純化，獲得純菌落，并進行真菌的分子鑒定和保存。將獲得的真菌和兜唇石斛的種子進行共生萌發培養，設置對照實驗，以檢驗所獲得的真菌對兜唇石斛的種子萌發的有效性，結果表明所獲得的真菌是兜唇石斛種子萌發的有效共生真菌，從而實現了本發明的目的。

一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，包括以下步驟：

(1)在兜唇石斛花期進行人工異交授粉，果實成熟但果莢尚未裂開時收獲果實，將種子干燥后置于無菌的密閉玻璃容器中在-20℃條件下保存，待用；

(2)用滅菌的鑷子將100～200粒兜唇石斛的種子播種在尼龍網布上，將播好種子的尼龍網布對折，用熱封機將三邊封起來，制作完成種子袋，在種子袋邊緣縫上標簽，便于監測和回收；

(3)選擇有兜唇石斛成年植株自然生長的不同地點，將種子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的樹干上，在種子袋上面覆蓋一層苔蘚保濕；

種子袋放置時應盡量靠近成年植株根部，并使種子袋呈水平狀態，避免種子在重力作用下聚集成團。

(4)每個月定期從各放置點回收2～3個種子袋，檢查種子袋內種子的萌發情況，當發現有原球莖時，回收所有的種子袋；

(5)將回收的原球莖依次用自來水沖洗，次氯酸鈉溶液消毒，無菌水漂洗后切成兩半，切口面貼于馬鈴薯葡萄糖培養基PDA上進行培養；

(6)原球莖切口處長出菌絲時，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養基上，轉移3～5次后，得到純菌落；

(7)將兜唇石斛的種子放入無菌水中制成均勻的懸浮液，在配制好的燕麥瓊脂培養基(OMA)的培養皿表面放置兩張無菌濾紙，分別吸取150微升的種子懸浮液均勻地散布在兩張濾紙條上；在培養基中心接種含有不同來源的單一共生真菌純培養物的瓊脂塊，同時設置不接菌的對照處理組，每個處理10個重復，用封口膜密封后置于人工氣候箱中培養；

(8)每周觀察1次不同處理的種子，記錄種子萌發數量及萌發時間，對種子萌發和原球莖發育情況進行分級，記錄每一階段內種子或原球莖的數量，通過和不接菌處理組的對比，篩選出兜唇石斛種子萌發的有效共生真菌。

上述步驟中，所述的種子袋采用網孔為45μm的尼龍網布。這樣的網孔大小既可以保持種子不掉出，又可以使水和真菌的菌絲自由穿過，熱封機封口時應避免損傷種子。

步驟(3)中所述的種子袋放置點為同時有兜唇石斛成年植株和自然更新的幼苗處。

步驟(4)回收后的種子袋用自來水輕輕沖洗掉附著物及泥土，將清洗后的種子袋放在兩層面巾紙中間，輕輕按壓使面巾紙吸干種子袋多余的水分，用剪刀小心的剪開封口，打開種子袋放在解剖鏡下觀察種子萌發情況。