[發(fā)明專利]一種疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210097467.3
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102604913A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李新良;張珊嘉;張民;唐鵬;段園園;馬天畫;王錫珍
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南尤特爾生化有限公司;上海尤特爾生化有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/80;A21D8/04;C12R1/885
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

1)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因的合成；

2)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；

3)里氏木霉的轉(zhuǎn)化與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶高產(chǎn)菌株的篩選；

4)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的分離與提純。

2.如權(quán)利要求1所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，步驟1)中，合成的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因的序列如SEQ?ID?NO.1所示，合成的基因編碼更加符合里氏木霉高效表達(dá)的基因編碼。

3.如權(quán)利要求1所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，步驟2)具體為：將步驟1)所得的產(chǎn)物由SpeI和XhoI限制性內(nèi)切酶降解后，用瓊脂糖凝膠分離，純化回收連接，然后通過T4?DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α通透細(xì)胞，通過分析篩選提取質(zhì)粒，完成疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。

4.如權(quán)利要求1所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，步驟3)具體為：首先，用EcoRI降解步驟2)構(gòu)建的質(zhì)粒形成質(zhì)粒片段，采用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將該質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)入里氏木霉RUT?C-30宿主細(xì)胞；然后在含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將生長旺盛的菌落接種置PDA培養(yǎng)基上，通過生長和發(fā)芽，將孢子再轉(zhuǎn)移到新鮮PDA培養(yǎng)基上，以分離純化轉(zhuǎn)代穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，將這些轉(zhuǎn)化子的孢子接種在木霉纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)液，培養(yǎng)后，采樣離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

5.如權(quán)利要求4所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述木霉纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)液的pH值為4.8，用乳糖作為誘導(dǎo)物。

6.如權(quán)利要求1所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，步驟4)完成后，得到的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示。

7.一種采用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的制備方法制得的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶。

8.一種如權(quán)利要求7所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在制備面制食品中的應(yīng)用。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述面制食品為饅頭。