[發(fā)明專利]一種檢測狂犬病毒屬病毒的CODEHOP RT-PCR試劑及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210097098.8
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102643929A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡群;馬思杰;倪紅霞;郭利平;謝東華
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國大榭出入境檢驗(yàn)檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及狂犬病毒的檢測技術(shù)，具體涉及一種檢測狂犬病毒屬病毒的CODEHOP?RT-PCR試劑及方法。

背景技術(shù)

狂犬病毒屬分為7個(gè)基因型：狂犬病病毒（classical?rabies?virus），拉各斯蝙蝠病毒（Lagos?bat?virus），莫科拉病毒（Mokola?virus），杜文海格病毒（Duvenhage?virus），歐洲蝙蝠狂犬病毒1型（European?bat?lyssavirus?types?1）,?歐洲蝙蝠狂犬病毒2型（European?bat?lyssavirus?types?2?），澳大利亞蝙蝠狂犬病毒（Australian?bat?lyssavirus）。國內(nèi)流行的野毒株為基因1型，近十年來中國狂犬病的發(fā)病率及死亡率一直維持在每年超過2000人的高位。基因2型~6型僅在非洲和歐洲發(fā)現(xiàn)，5型和6型在歐洲蝙蝠中比較普遍，雖感染人的病例不多，但幾乎每型病毒都曾致死人?？紤]到歐亞大陸的連續(xù)性和國際貿(mào)易的頻繁往來，無法排除其余基因型狂犬病毒的傳入。目前，狂犬病毒的檢測方法主要有病毒分離、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒、血清學(xué)檢測方法和基因檢測方法。基因檢測方法主要是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），如授權(quán)公告號為CN?101153344，名稱為狂犬病毒套式RT-PCR檢測方法及檢測試劑盒的發(fā)明專利，就公開了以外套PCR預(yù)混體系和內(nèi)套PCR預(yù)混體系的RT-PCR技術(shù)，可以完成全部7個(gè)基因型的檢測，外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小是845bp，內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小是371bp，內(nèi)套引物是以不同基因型RV特點(diǎn)設(shè)計(jì)的簡并引物。該發(fā)明專利雖然可檢測所有狂犬病毒屬的基因型，但需要外套PCR預(yù)混體系和內(nèi)套PCR預(yù)混體系二種檢測試劑共同檢測，檢測方法復(fù)雜，檢測時(shí)間也較長，且不能有效確認(rèn)具體基因型，更無法鑒定狂犬病毒屬內(nèi)的未知病毒或可能出現(xiàn)其他基因型的病毒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測狂犬病毒屬病毒的CODEHOP?RT-PCR試劑及方法，該CODEHOP?RT-PCR試劑只用一組引物下，特異性更；用該CODEHOP?RT-PCR試劑檢測狂犬病毒屬時(shí)間較短，方法簡便，靈敏性高，且可以確認(rèn)具體基因型，以及鑒定狂犬病毒屬內(nèi)的未知病毒或可能出現(xiàn)其他基因型的病毒。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種檢測狂犬病毒屬的CODEHOP?RT-PCR試劑，包括引物溶液，所述引物溶液中含有核苷酸序列為5’-TTTGTTTTCT?GACAAGAATG?ACAAATatha?ayathaa?-3'的上游引物KQZ1，和核苷酸序列為5’-TTTTGCTGCA?TGTCTAACTT?Cttgrtcnac?cca?-3'的下游引物KQZ2，上述序列中其中h含義為a或c或t/u，y含義為c或t/u，r含義為g或a，n含義為g或a或c或t/u或其它。?

檢測狂犬病毒屬病毒的方法，其步驟如下：

a、RNA提?。河肦NA提取試劑盒（購自Qiagen公司）提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說明書進(jìn)行；

b、RNA逆轉(zhuǎn)錄：用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購于Promega公司）對上述RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到PCR模板，具體逆轉(zhuǎn)錄方法依說明書進(jìn)行：在0.2mL?eppendorf管中加入oligo?d(T)₁₅?primers（50mM）1μL，上述RNA?10μL，72℃?10.min?，再加入反應(yīng)試劑，20μL反應(yīng)體系中AMV反轉(zhuǎn)錄酶終濃度為0.5U/μL，RNA酶抑制劑終濃度為0.5U/μL，dNTP終濃度為0.5mM，4μL?RT-buffer?5?×，反應(yīng)條件為42℃60min，72℃10min；反應(yīng)產(chǎn)物即為后續(xù)的PCR模板；

c、PCR反應(yīng)：在0.2mL?eppendorf管中加入10×PCR緩沖液（PCR?buffer）2.5μL、濃度為25mM的?MgCl₂溶液1.5μL、濃度為10mM的?dNTP液0.5μL、濃度為5U/μL的Taq酶液?0.5μL、含濃度都為25μM的上游引物KQZ1和下游引物KQZ2的引物溶液1μL、上述PCR模板2μL，滅菌去離子水16μL，組成PCR反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃?延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，4℃保存PCR產(chǎn)物；?