[發明專利]一種臍帶間充質干細胞生物學效力的檢測方法

有效

• 申請號: 201210096807.0
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102643909A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 劉廣洋;朱德琳;劉擁軍;徐燚;聶艷波
• 申請（專利權）人: 天津和澤干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及干細胞檢測技術，具體地說，涉及一種臍帶間充質干細胞生物學效力的檢測方法。?

背景技術

臍帶間充質干細胞(umbilical?cord-mesenchymal?stem?cells，UC-MSCs)是從臍帶組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。臍帶是懷孕期間連接母體與胎兒之間的組織，由兩條動脈、一條靜脈和粘液結締組織(Wharton’s?Jelly)構成。臍帶膠、臍帶血管壁和血管周圍均富含基質間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)和MSCs樣細胞(包括基質細胞、血管周細胞等)。自2003年Mitchell等[1]首次自臍帶中成功地分離出基質細胞并證實其神經分化潛能后，對臍帶組織來源MSCs的研究引起了廣泛關注。?

臍帶來自于胎兒生產后的廢棄物，從臍帶中獲取MSCs，資源豐富、質量高、較純凈；比從成體組織中獲取MSCs細胞在供者來源、細胞數量及增殖潛能、病毒感染率方面都有明顯優勢。另外UC-MSCs具有高度的分化潛能，良好的免疫調節能力，同時具有低免疫原性，異體移植時可避免排斥反應，使其具有重要的研究和應用前景，特別在治療免疫相關疾病方面均具有重要的臨床應用價值。?

然而，由于細胞治療本身的特點，間充質干細胞用于臨床治療還具有某些方面的限制因素。其中最典型的方面是缺乏有效而快捷的具有針對性的生物學效力檢測手段。目前多數臨床前或臨床使用的間充質干細胞產品都是依據2006年國際細胞治療協會提出的三條定義間充質干細胞標準[2]，而缺乏針對某一類疾病的可以定義細胞質量或初步判斷細胞治療效果的方法。?

為克服以上問題的不足，我們對UC-MSCs分泌的一種糖蛋白?-galectin-3(半乳糖凝聚素-3)進行了系統研究，該蛋白是galectins(半乳糖凝聚素)家族的一員，分子量為26kD，大量研究表明該蛋白可有效抑制T淋巴細胞的增殖，促進T淋巴細胞的凋亡[3-7]。?

我們在研究中發現UC-MSCs在核酸水平和蛋白水平均有較高劑量的galectin-3表達，而該蛋白在MSC的表達又分為分泌型的和膜表達型。我們通過RNA干擾試驗和Transwell小室共培養試驗發現分泌型的galectin-3在臍帶間充質干細胞免疫調節方面發揮主要作用，我們同時檢測了該蛋白在連續數批UC-MSC上清中的表達，由此提出了一種檢測MSC免疫抑制效力的新方法。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有間充質干細胞生物學效力檢測手段的不足，建立一套有效檢測UC-MSC免疫抑制能力的新方法。?

本發明提供了一種臍帶間充質干細胞生物學效力的檢測方法，其特征在于通過檢測臍帶間充質干細胞培養上清液中galectin-3的含量來判斷其免疫抑制效力。?

在一個特定的實施方案中，所述臍帶間充質干細胞為人臍帶間充質干細胞，并且其判斷標準為：人臍帶間充質干細胞培養上清液中galectin-3的含量以2.62ng/ml為閾值，低于此數值的判定為人臍帶間充質干細胞免疫抑制效力不合格。?

優選地，使用ELISA方法檢測臍帶間充質干細胞培養上清液中galectin-3的含量。?

盡管之前的研究已經發現galectin-3表達與UC-MSC免疫抑制能力之間存在密切關系，但并沒有開發出一套成熟的臍帶間充質干細胞生物學效力的檢測方法。本發明首次發現分泌型的galectin-3在UC-MSC免疫抑制過程中起主要作用，并在此基礎上開發出一套有效檢測UC-MSC免疫抑制能力的方法。本發明的方法以臍帶間充質干細胞培養上清液中的分泌型galectin-3蛋白質為檢測對象，相比膜表達型galectin-3蛋白質的檢測，針對?性強，定量準確；并且由于不需要消化細胞，可適用于大規模連續臍帶間充質干細胞培養時免疫抑制效力的檢測。本發明的方法檢測樣本處理簡便，并可使用儀器進行自動或半自動檢測。?

附圖說明

圖1A.PCR結果分析hUC-MSC?mRNA水平表達galecitn-3，其中1、3、5分別是三批細胞表達galectin-3的條帶，2、4、6為相應細胞的β-actin。?

圖1B.real-time?qPCR結果分析3批hUC-MSC于P2～P5不同代次mRNA水平表達galecitn-3。以β-actin作為內參，對galectin-3的Cp值進行2^-ΔCt分析。?

圖2.Westernblot結果分析hUC-MSC上清液和RIPA裂解液中galecitn-3的表達。?