[發(fā)明專利]基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變機(jī)制檢測汞離子殘留的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210095340.8
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN102621120A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉賢金;雷兆靜;張存政;劉媛
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 孫忠浩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及汞離子濃度檢測范圍，特別是基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變機(jī)制檢測汞離子殘留的方法。

背景技術(shù)

汞是環(huán)境中重金屬污染的重要元兇之一，是一種具有嚴(yán)重生物毒性的化學(xué)物質(zhì)，由于其具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性，使汞成為目前最受關(guān)注的環(huán)境污染物之一，尤其是溶解態(tài)的Hg²⁺具有較高的化學(xué)活性和穩(wěn)定性，是排入環(huán)境水體中污染物的主要存在形式，對細(xì)胞具有腐蝕性和致癌性，因此發(fā)展無污染的、簡便快速、高靈敏度和高特異性的方法進(jìn)行汞離子的檢測成為必要，開發(fā)和研究新的檢測汞離子的材料和方法成為熱點(diǎn)。

隨著指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment）的發(fā)展和應(yīng)用，越來越多的對靶分子具有親和性和特異性的核酸適體從大容量的寡核苷酸庫中篩選獲得，研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)汞離子能特異地和兩個(gè)胸腺嘧啶堿基（T）共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的T-Hg²⁺-T結(jié)構(gòu)，利用這一原理，已經(jīng)建立了多種基于熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變的檢測汞離子的方法，如Akira?Ono等設(shè)計(jì)了一條富含堿基（T）的寡核苷酸序列，其5’端標(biāo)記有猝滅素，3’端標(biāo)記有熒光素，當(dāng)汞離子存在時(shí)，由于T-Hg²⁺-T的結(jié)合作用而使寡核苷酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致3’端和5’端靠近引起熒光猝滅從而對汞離子進(jìn)行定量測定（Akira?Ono,?Humika?Togashi.?Angew.?Chem.,?2004,?116:?4400~4402）。而Wang?Z?D也是利用T-Hg²⁺-T的結(jié)合原理設(shè)計(jì)了發(fā)夾結(jié)構(gòu)的汞離子的寡核苷酸適體，通過熒光強(qiáng)度的上升定量檢測汞離子（Wang?Z?D,?Lee?J?H,?Lu?Y.?Chem.?Commun.,?2008,?45:?6005~6007）。

采用源于鎳離子RNA核酸適體的堿基序列合成的DNA堿基序列，再對它的部分堿基進(jìn)行改造后獲得新的汞離子核酸適體，并設(shè)計(jì)與該汞離子核酸適體匹配的互補(bǔ)序列Q2，建立新的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變機(jī)制，利用它們檢測汞離子殘留，目前未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：打破之前固有的基于T-Hg²⁺-T結(jié)構(gòu)建立的檢測方法和模式，開創(chuàng)汞離子新型的核酸適體，并利用熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化機(jī)制建立新的檢測汞離子的方法，并將其應(yīng)用于環(huán)境水中汞離子檢測，達(dá)到快速、簡便、準(zhǔn)確、樣品需求量少的檢測目的。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種基于核酸適體結(jié)構(gòu)的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變機(jī)制檢測汞離子殘留的方法，是以標(biāo)記有熒光基團(tuán)FAM的汞離子核酸適體與標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)DABCYL的互補(bǔ)序列構(gòu)成熒光檢測體系，其特征在于：所述的汞離子核酸適體為源于鎳離子RNA核酸適體的堿基序列合成的DNA堿基序列SEQ?ID?N_O.7中截取的第23位至第44位堿基序列，并對該部分堿基序列進(jìn)行改造后獲得，獲得的汞離子核酸適體是由27~28個(gè)堿基組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，擁有堿基GGAC和GTCC共價(jià)結(jié)合形成的莖，所述互補(bǔ)序列Q2的堿基序列為SEQ?ID?N_O.1；熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變機(jī)制檢測汞離子殘留的方法為：

a)?將以標(biāo)記有熒光基團(tuán)FAM的汞離子核酸適體和標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)DABCYL的互補(bǔ)序列Q2按照濃度比1:2~4投放在bufferA緩沖液中，經(jīng)過變性和復(fù)性，以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，進(jìn)行熒光檢測，記錄熒光強(qiáng)度；

b)將含有不同濃度汞離子的標(biāo)樣分別加入含有復(fù)合物的bufferA緩沖液，經(jīng)過變性和復(fù)性，汞離子與互補(bǔ)序列Q2競爭結(jié)合核酸適體，以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，分別進(jìn)行熒光檢測，記錄與不同濃度汞離子標(biāo)樣對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定該復(fù)合物的相關(guān)系數(shù)、最小檢出限以及線性檢測范圍，建立與線性檢測范圍對應(yīng)的線性方程；

c)?向含有復(fù)合物的bufferA緩沖液中加入待測物質(zhì)，經(jīng)過變性和復(fù)性，待測物質(zhì)中的汞離子與互補(bǔ)序列Q2競爭結(jié)合核酸適體，以485nm為激發(fā)波長，535nm為發(fā)射波長，進(jìn)行熒光檢測，記錄待測物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；

d)將待測物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與線性檢測范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定或通過線性方程計(jì)算得到待測物質(zhì)中的汞離子殘留量；

所用bufferA緩沖液的成分為：50mM?NaCl+7mM?MgCl2+50mM?Tris/HCl，bufferA緩沖液的PH=7.5；