[發明專利]焦磷酸測序法檢測伊立替康個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201210094436.2
• 申請日: 2012-04-01
• 公開（公告）號: CN102643906A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 周宏灝
• 申請（專利權）人: 周宏灝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及焦磷酸測序法檢測伊立替康個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法。

背景技術

伊立替康系喜樹堿類前藥，在體內可經羧酸酯酶代謝成活性形式7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)。SN-38作用靶點是DNA拓撲異構酶I，可干擾DNA復制和轉錄，可抑制DNA合成，具有較強殺傷腫瘤活性。廣泛應用于胃癌、結直腸癌、肺癌等實體瘤治療，可顯著提高患者總生存期。但伊立替康治療時，嚴重的毒副反應發生率較高，特別是可導致嚴重的延遲性腹瀉和粒細胞缺乏，使其臨床應用受到影響。臨床研究表明，40％以上接受伊立替康治療的患者可出現3～4級遲發性腹瀉，約10％患者可出現嗜中性白血球減少癥，從而導致化療方案提前中止。SN-38經肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT1A1)葡萄糖醛酸化滅活，生成葡萄糖醛酸化SN-38(SN-38G)，從而保護健康細胞免受伊立替康毒性的影響。UGT1A1基因呈多態性，最常見的是啟動子區域的UGT1A1*28，野生型有6個AT重復，突變體為7個AT重復。含有較高數目的TA重復序列即TA7患者，與野生型TA6比較，UGTIAI基因的表達量降低且活性也降低。此外在UGT1A1基因1號、4號和5號外顯子上核苷酸的改變也產生了一系列活性降低的突變體(UGT1A1*6、UGT1A1*7、UGT1A1*27、UGT1A1*29)。突變型UGT1A1*28的雜合子比野生型對SN-38的葡萄糖醛苷化活性稍低，而UGT1A1*28的突變純合子對SN-38的葡萄糖醛苷化活性則僅是野生型的35％，從而更容易產生毒副作用。野生型UGT1A1(6/6)在接受伊立替康治療時產生毒副作用風險較低，而UGT1A1*28突變型雜合子(6/7)產生毒副作用的幾率為12.5％，突變型純合子(7/7)則有50％產生毒副作用的可能性。該突變的影響是與劑量相關的，在使用低劑量伊立替康治療時，UGT1A1突變與否對毒副作用的風險影響不大。學者針對118名服用依利替康的日本癌癥患者進行了病例對照研究，在這118人中有26人發生了嚴重不良反應(發生頻率為22％)，包括4級粒細胞減少，4級血樣便腹瀉或脫水，3級水樣便腹瀉。在出現嚴重不良反應的26人中，發生UGT1A1*28突變的有12人(46％，其中純合子4人，雜合子8人)，另外沒有發生不良反應中的92人中有13人是UGT1A1*28的突變的個體(14％)。研究者發現UGT1A1*28突變純合子嚴重腹瀉的發生率為70％，而*28突變雜合子和野生型純合子中的發生率分別為33％和17％；另有研究證實4級粒細胞減少癥的發生率在MM，WM和WW個體中的發生率分別為50％，12.5％和0。美國FDA明文規定UGT1A1*28突變的純合子和雜合子的個體發生嚴重不良反應的風險極大的增加了(約7倍)，應當嚴加監控。在中國人中，野生型純合子(6/6)、雜合子(6/7)和突變型純合子(7/7)的發生頻率分別為70.2％、27.7％和2.1％。UGT1A1*6(G71R，211G＞A)13％東方人特有。有研究顯示UGT1A1*6突變使UGT1A1的葡萄糖醛酸化的能力下降70％，使伊立替康的毒副作用風險顯著增加。

綜上UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多態性是影響伊立替康需求劑量差異性的主要因素，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多態性的試劑盒將為伊立替康的臨床個體化治療起到積極的推動作用。

焦磷酸測序(Pyro?sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容

UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多態性是影響伊立替康劑量個體差異的最主要因素。本發明提供一種檢測影響臨床伊立替康個體化用藥治療的用藥基因UGT1A1*6(SEQ?IDNO.1)和UGT1A1*28(SEQ?IDNO.2)多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測伊立替康個體化用藥相關基因SNP。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：

一種焦磷酸測序法檢測伊立替康個體化用藥基因多態性的試劑盒，其特征在于，包括如下引物：

(1)擴增引物：