[發(fā)明專利]焦磷酸測序法檢測他莫昔芬個體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210094422.0
• 申請日: 2012-04-01
• 公開（公告）號: CN102643905A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周宏灝
• 申請（專利權(quán)）人: 周宏灝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測序法檢測他莫昔芬個體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒及方法。

背景技術(shù)

他莫西芬是一種非固醇類抗雌激素藥物，目前廣泛用于雌激素受體陽性的乳腺癌患者的預(yù)防和治療。在體內(nèi)他莫西芬的代謝有多種藥物代謝酶參與，大約10％他莫西芬由CYP2D6代謝成活性代謝產(chǎn)物4-羥基-N-去甲基他莫西芬(endoxifen)。在中國人群中，CYP2D6最常見的功能減弱等位基因突變型為CYP2D6*10(約占53％)。在一項200名乳腺癌患者接受TAM作為輔劑的療法中，CYP2D6慢代謝者無瘤生存率較低，這與活性代謝產(chǎn)物endoxifen生成減慢從而導(dǎo)致療效的下降相一致。在另一項293名接受治療的乳腺癌患者中，攜帶CYP2D6*10等位基因的T/T型患者與C/T型或C/C型患者相比，血中4-羥-他莫西芬(另一活性代謝產(chǎn)物)較低，且臨床結(jié)果較差。接受他莫昔芬治療的乳腺癌患者的CYP2D6基因型與血液中活性代謝產(chǎn)物的濃度密切相關(guān)，并因此顯著影響患者的復(fù)發(fā)率和生存期。因此美國FDA已于2006年建議患者在接受他莫昔芬治療前首先對CYP2D6的基因型進行檢測。

他莫昔芬經(jīng)CYP2D6代謝為活性代謝產(chǎn)物4-OH-他莫昔芬后結(jié)合雌激素受體的能力大大增強，該4-OH-代謝產(chǎn)物由SULT1A1硫酸鹽化作用代謝失活，因此SULT1A1基因多態(tài)性或者活性對于他莫昔芬的療效具有重要影響。His213(SULT1A1*2)造成酶活性降低2倍且蛋白穩(wěn)定性降低，造成4-OH-代謝產(chǎn)物難以代謝為活性硫酸鹽-他莫昔芬，據(jù)推測該次級代謝產(chǎn)物的藥理活性更高。因此，如果該產(chǎn)物不能形成，化療效果及存活率將大大降低。

綜上所述，CYP2D6*10(rs1065852)和SULT1A1*2(rs9282861)基因多態(tài)性是影響他莫昔芬需求劑量差異性的主要因素，開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟的檢測CYP2D6*10和SULT1A1*2基因多態(tài)性的試劑盒將為他莫昔芬的臨床個體化治療起到積極的推動作用。

焦磷酸測序(Pyro?sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容

CYP2D6*10(rs1065852)和SULT1A1*2(rs9282861)基因多態(tài)性是影響他莫昔芬劑量個體差異的最主要因素。本發(fā)明提供一種檢測影響臨床他莫昔芬個體化用藥治療的用藥基因CYP2D6(SEQ?ID?NO.1)和SULT1A1(SEQ?ID?NO.2)多態(tài)性的試劑盒及方法，以實現(xiàn)快速、簡便、準(zhǔn)確、高效、實用、經(jīng)濟的檢測他莫昔芬個體化用藥相關(guān)基因SNP。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種焦磷酸測序法檢測他莫昔芬個體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物：

(1)擴增引物：

CYP2D6*10(rs1065852)上游引物：5′-GTA?GTG?AGG?CAG?GTA?TGGG-3′(SEQ?ID?NO.3)；

SULT1A1*2(rs9282861)上游引物：5′-GGA?GAT?TCA?AAA?GAT?CCTGGA-3′(SEQ?IDNO.4)；

CYP2D6*10(rs1065852)下游引物：5′-CAG?GAC?CTC?CTC?CCT?CAC?CTGGTC-3′(SEQ?IDNO.5)；

SULT1A1*2(rs9282861)下游引物：5′-TTC?ATC?TCC?TTG?AAC?GAC?G-3′(SEQ?IDNO.6)；

其中，下游引物的5′進行生物素標(biāo)記；

(2)測序引物：

CYP2D6*10(rs1065852)測序引物：5′-GCA?GGG?GGC?CTG?GTG-3′(SEQIDNO.7)；

SULT1A1*2(rs9282861)測序引物：5′-TGG?AGT?TTG?TGG?GGC-3′(SEQ?ID?NO.8)；

試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。

一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測他莫昔芬用藥基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶鏈反應(yīng)：