[發明專利]HA-VP2基因重組桿狀病毒表達載體的構建方法

無效

• 申請號: 201210093043.X
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102618579A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 葛菁萍;高冬妮;宋剛;凌宏志;平文祥;樓莊偉;唐曉艷;金麗穎;安琪;田兆峰
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發明涉及基因重組桿狀病毒表達載體的構建方法。

背景技術

傳染性法氏囊病是危害世界養禽業的主要傳染病之一。目前，對于傳染性法氏囊病的防治仍是以傳統疫苗為主，但是由于病毒抗原的不斷變異，特別是超強毒株的出現，使得此病的防控形勢更加嚴峻，而且現存的桿狀病毒介導的外源基因在CHO細胞中的表達率較低。因此，研制新型、高效的基因工程疫苗來解決傳統疫苗防治的弊端顯得尤為重要。研究認為VP2蛋白是傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要結構蛋白，也是宿主的保護性抗原。應用改進的重組桿狀病毒表達系統在哺乳動物細胞中表達VP2抗原蛋白是新型禽類基因工程疫苗研制的關鍵性問題。

發明內容

本發明是要解決目前桿狀病毒介導的外源基因在CHO細胞中的表達率較低的問題，提供HA-VP2基因重組桿狀病毒表達載體的構建方法。

HA-VP2基因重組桿狀病毒表達載體的構建方法，按以下步驟進行：

一、以質粒pMD18-T-VP2為模板，TZF-1和TZF-2為引物，進行PCR擴增，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用膠回收試劑盒進行純化回收，獲得目的片段，然后進行目的片段的TA克隆，所得產物再與pMD18-T載體連接，連接產物經鑒定后獲得質粒pTZF-HA-VP2；

二、質粒pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC和pTZF-HA-VP2分別進行EcoR?I/Sal?I雙酶切，酶切后獲得的目的片段pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC分別與酶切后的pTZF-HA-VP2用T4DNA連接酶進行連接，九種連接產物經鑒定后獲得九種重組轉移載體，分別為pTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA-VP2、pTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM-I-HA-VP2、pTZF-SD-HA-VP2、pTZF-SD-I-HA-VP2、pTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA-VP2和pTZF-SDC-HA-VP2；

三、將九種重組轉移載體分別轉化E.coli?DH10?Bac感受態細胞，經藍白篩選后挑取白色單菌落，然后提取九種重組Bacmid?DNA，統稱為重組桿狀病毒穿梭質粒rBac-TZF-X；

四、利用脂質體介導轉染法將重組桿狀病毒穿梭質粒rBac-TZF-X轉染af9細胞，獲得九種重組桿狀病毒rBV-TZF-X，分別為rBV-TZF-WK-HVP2、rBV-TZF-WK-I-HVP2、rBV-TZF-LM-HVP2、rBV-TZF-LM-I-HVP2、rBV-TZF-SD-HVP2、rBV-TZF-SD-I-HVP2、rBV-TZF-WKC-HVP2、rBV-TZF-LMC-HVP2和rBV-TZF-SDC-HVP2，即完成HA-VP2基因重組桿狀病毒表達載體的構建；

其中步驟一中引物TZF-1序列為5’-CCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC-3’；引物TZF-2序列為5’CGCGTCGACTTACCTTATGGCCCGGATTATGTCTTT-3’。

本發明通過構建了重組轉移載體pTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA-VP2、pTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM-I-HA-VP2、pTZF-SD-HA-VP2、pTZF-SD-I-HA-VP2、pTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA-VP2和pTZF-SDC-HA-VP2，融合蛋白HA-VP2可在其內成功表達，且具有抗原性；這為進一步開發以本發明改造的桿狀病毒轉移載體為基礎的基因工程疫苗奠定了基礎。本發明還證實了添加調控元件WPRE可以提高桿狀病毒介導外源基因在CHO細胞中的表達率，從而確定了重桿狀病毒表達載體表達HA-VP2蛋白的強度。

附圖說明

圖1為具體實施方式一中SDS-PAGE鑒定HA-VP2蛋白的表達的電泳圖，其中泳道1、2、3、4、5和6為經重組桿狀病毒rBV-TZF-X侵染sf9昆蟲細胞裂解物，泳道7為未經病毒侵染的細胞對照裂解物；

圖2為具體實施方式一中SDS-PAGE鑒定HA-VP2蛋白的表達的電泳圖，其中泳道8、9和10為經重組桿狀病毒rBV-TZF-X侵染sf9昆蟲細胞裂解物，泳道11為未經病毒侵染的細胞對照裂解物；