[發(fā)明專利]用BsrFI鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210091430.X
• 申請日: 2009-12-24
• 公開（公告）號: CN102660639A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設計）人: 楊永利;姚武;王威
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京智匯東方知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11391
• 代理人: 張群峰;康正德

本申請是申請?zhí)枮椤?00910227637.3”、申請日為2009年12月24日、發(fā)明名稱為“鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。

技術領域

本發(fā)明涉及鑒定單核苷酸多態(tài)性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的方法。

背景技術

SNP(單核苷酸多態(tài)性)是指單個核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基的置換、插入和缺失等形式。SNP現(xiàn)已廣泛用于簡單和復雜疾病的遺傳連鎖分析、關聯(lián)分析及疾病易感基因的定位，指導易感基因克隆。聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(tài)(PCR-RFLP)技術是一種快速、簡便、準確、低成本檢測SNP基因型的經(jīng)典方法。該方法原理是：限制性內(nèi)切酶是一類識別DNA特異位點(通常4～6bp)，并在特異位點進行切割的酶類。酶切位點的特異性意味著對特定DNA等位基因的完全消化會產(chǎn)生同樣的片段序列。而堿基的替換或插入、缺失可以產(chǎn)生或消除一個特定酶切位點，從而改變酶切割后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目。這些酶切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態(tài)性。如果SNP產(chǎn)生和消除了某個限制性內(nèi)切酶位點，則可以通過對PCR產(chǎn)物進行酶切、電泳加以檢測。該方法主要優(yōu)點在于操作簡便，快速，終點判斷準確。主要缺點在于酶切位點的選擇，并不是所有的SNP位點都可以使用該方法來鑒別，且部分內(nèi)切酶價格昂貴。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate?reductase，MTHFR)是一種重要的葉酸代謝酶，體內(nèi)催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為體內(nèi)最主要的甲基供體5-甲基四氫葉酸，具有重要的生理功能。目前研究發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白的基因缺陷與動脈硬化性血管阻塞性疾病密切相關，還是胎兒神經(jīng)管畸形及癌癥發(fā)生的遺傳因素。人MTHFR基因定位于染色體1P36.3，該基因第十二外顯子A/G堿基變異可引起第594位氨基酸變異(Gln/Arg)，文獻中常記為1793A/G多態(tài)，該多態(tài)可能影響MTHFR的功能。美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學圖書館生物信息技術中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可查閱MTHFR基因及其多態(tài)序列和相關信息，該多態(tài)在SNP數(shù)據(jù)庫中編號為rs2274976。因此，通常該多態(tài)在人群中存在三種MTHFR基因的基因型：GG型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為G)，AG型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為G和A)和AA型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為A)。

目前人MTHFR基因多態(tài)rs2274976的鑒定常采用PCR-RFLP方法。目前鑒定人MTHFR基因多態(tài)rs2274976時常使用內(nèi)切酶BsrBI進行鑒定，該內(nèi)切酶的價格昂貴(關于部分內(nèi)切酶的參考價格可以參考后面的表1)，影響了實驗的費用，難以在實驗室中普及使用。并且由于傳統(tǒng)PCR-RFLP方法的固有缺陷，本領域技術人員通常難以選擇其他限制性內(nèi)切酶對人MTHFR基因多態(tài)rs2274976進行鑒定。

因此，本領域存在對操作簡單，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP的方法的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種操作簡單，成本低，使用范圍廣的鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的方法，其包括以下步驟：

a)提供待測人基因組DNA；

b)使用擴增人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，以所述待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應，獲得擴增產(chǎn)物；

c)使用限制性內(nèi)切酶對所述擴增產(chǎn)物進行酶切，獲得酶切產(chǎn)物；以及

d)對所述酶切產(chǎn)物進行電泳，以鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976，其中，所述正向引物其3’末端倒數(shù)第一位堿基與多態(tài)rs2274976堿基相鄰，倒數(shù)第二位堿基為錯配堿基C，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)G等位基因形成CCGG(第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基G為多態(tài)等位基因)或ACCGGT(第二個堿基C為錯配堿基，第四個堿基G為多態(tài)等位基因)結(jié)構，或者與多態(tài)A等位基因形成CCAGT(第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基A為多態(tài)等位基因)結(jié)構。