[發(fā)明專利]一種高效CpG制劑及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210090979.7
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN102631675A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張玲華;李華周;姜增固
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K47/44
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明;任重

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用疫苗技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種獸用疫苗佐劑及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種高效的疫苗佐劑CpG制劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

國內(nèi)眾多獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)的疫苗佐劑均是用鋁佐劑或油佐劑，但該類佐劑有一定的副作用，油乳劑刺激局部產(chǎn)生肉芽腫或炎癥反應(yīng)：鋁佐劑可以引起注射部位局部炎癥反應(yīng)進而引起肉芽腫，個別的引起畜禽應(yīng)激性反應(yīng)導(dǎo)致個別個體死亡。且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是屬于Th2型的，不足以起到完全的保護動物防感染的作用。雖然能增強體液免疫，抗體以IgGⅠ類為主，不能明顯地提高細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，不能增強細胞免疫，有局限性；還可能對動物體的神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害。主要適用于免疫能力強和可大量生產(chǎn)的抗原。因此制備安全高效的疫苗佐劑是非常必要的。

含有特定非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(CpG基序)的寡核苷酸，即CpG?ODN(CpG?oligodeoxynucleotides，CpG?ODN)是近年發(fā)現(xiàn)的被哺乳動物的免疫系統(tǒng)識別為“危險”信號的新型免疫增強劑，能激活人體和許多動物的先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。在多種動物模型上，已證實CpG?ODN可作為疫苗(包括人用疫苗)一種安全的疫苗佐劑，而且與傳統(tǒng)疫苗相比，可以較大程度減少疫苗抗原的使用量，因而過敏反應(yīng)的可能性大幅度降低，部分已進入人體的二期臨床研究(Murad和Clay，2009；Vollmer和Krieg，2009)。

由于CpG?ODN是一種安全的佐劑，多次動物實驗已經(jīng)證實高達100倍常規(guī)劑量的CpG?ODN注射小鼠未發(fā)現(xiàn)明顯的急性毒性作用，反復(fù)注射CpG?ODN可為長期預(yù)防傳染性病原體提供一種安全的方法(Klinman等，1999)。CpG?ODN作為佐劑，可以誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，提升細胞免疫應(yīng)答的水平，還具有降低疫苗的使用量，減少過敏反應(yīng)等的優(yōu)點。

但是，目前尚沒有將CpG直接應(yīng)用到動物的疫苗免疫產(chǎn)品，主要原因在于其存在穩(wěn)定性不強，時間長存放易降解，導(dǎo)致藥效下降；保存條件較苛刻，要求在-20℃下等問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的獸用疫苗佐劑不足，尤其是具有副作用、誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答、只能適用于免疫能力強和可大量生產(chǎn)的抗原的技術(shù)難題，提供一種高效的疫苗佐劑CpG制劑，基于所述制劑，可成功實現(xiàn)降低疫苗的使用量、促進動物機體Th1型免疫的形成、提高疫苗的使用效果的目的。另一方面，本發(fā)明所述制劑較現(xiàn)有的CpG制劑更容易保存。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述CpG制劑的制備方法，所述的制備方法簡單易行。

本發(fā)明還有一個目的是提供所述CpG制劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種高效CpG制劑，包括按照以下比例組成的各組分：

所述CpG?ODN的序列為：5’-ggTGCATCGATGCAGggggg-3’，可采用現(xiàn)有基因工程或化學方法合成，其中g(shù)-表示該序列經(jīng)硫代化處理(硫代化處理可以參考本領(lǐng)域的常規(guī)工藝進行)。合成后，用無菌PBS溶液配制成10～45μg/ml，保存于-15～-25℃溫度下備用。所述PBS溶液組成為：按照重量百分比計，0.6～1.0％的NaCl、0.01～0.04％的KCl、0.0124～0.0164％的Na₂HPO₄、0.014～0.034％的KH₂PO₄溶于水中；然后采用濕熱高壓滅菌法在115～121℃下，滅菌15～25min。濕熱高壓滅菌法是本領(lǐng)域常用的滅菌方法，其操作可以參照現(xiàn)有技術(shù)進行。

本發(fā)明同時提供所述CpG制劑的制備方法，將人工合成的CpG?ODN與其他成份配合，再經(jīng)乳化后，制備成CpG制劑。具體包括以下步驟：

(1)CpG?ODN合成后，采用無菌PBS溶液配制成濃度為10～45μg/ml的CpG?ODN溶液，-15～-25℃溫度下保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取160～180ml白油和10～14ml?Span-80和6～10ml?Tween-80，混合均勻得混合液，60～80℃水浴處理；

(3)取20～40ml?EMULSIGEN水包油佐劑與步驟(2)所得混合液混合均勻，保存?zhèn)溆茫?/p>

(4)往步驟(1)所得80～120ml?CpG?ODN溶液中加入步驟(3)溶液中，混合均勻，室溫放置。

其中，步驟(2)所述混合均勻是在200～600rpm/min下攪拌4～8min；所述水浴處理是在60～80℃水浴20～30min。