[發(fā)明專利]無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210090795.0
• 申請(qǐng)日: 2012-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN102628028A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭榮梅;洪晶;靳瑛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)第三醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的制備方法，其特征是：

首先，用貼壁法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，隔天全量換干細(xì)胞培養(yǎng)基一次，待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全融合后，再培養(yǎng)7天以上作為待用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；

然后，取待用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用不含二價(jià)陽離子的緩沖液沖洗2次以上，在培養(yǎng)皿中加入配置好的二價(jià)陽離子螯合劑，待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片脫離培養(yǎng)皿，去除培養(yǎng)皿中的螯合劑，即獲得無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片；

最后，將無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片用干細(xì)胞培基沖洗2次以上，再加入干細(xì)胞培基保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的制備方法，其特征是：所述不含二價(jià)陽離子的緩沖液為PH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或D-Hank’s液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的制備方法，其特征是：所述配置好的二價(jià)陽離子螯合劑為濃度在0.01％～0.004％之間的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是：所述乙二胺四乙酸(EDTA)配置方法為將20mg乙二胺四乙酸(EDTA)溶于100mlPH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或D-Hank’s液中配置成濃度為0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，再將0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液稀釋，獲得濃度范圍在0.01％～0.004％之間的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的制備方法，其特征是：加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液后，培養(yǎng)皿周邊的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞首先脫離培養(yǎng)皿，脫離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與相鄰骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相連形成片狀，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脫離范圍從周邊逐漸向中央發(fā)展，最終完全脫離，形成無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片，隨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的脫離，無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片逐漸縮小變厚。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是：35mm大小的培養(yǎng)皿完全脫離時(shí)間為40秒～1分鐘，脫離后無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片面積大小為皿底的1/3，無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片所含細(xì)胞數(shù)量為10⁶數(shù)量級(jí)。

7.一種如權(quán)利要求1～6中任意一種方法制得的無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片，其特征是：無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的細(xì)胞密度大；可以有效避免因載體代謝所產(chǎn)生的不良作用；無載體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片經(jīng)胰酶消化、培養(yǎng)后，其增殖能力、形態(tài)及活性無明顯改變。