[發明專利]環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法

無效

• 申請號: 201210090007.8
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN102605087A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 曹冶;王秋實;廖黨金;趙素君;李江凌;謝晶;羅丹丹;葉勇剛
• 申請（專利權）人: 四川省畜牧科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/19;C12R1/42;C12R1/445;C12R1/46;C12R1/01
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 成實

技術領域

本實發明涉及一種微生物的處理方法，具體涉及的是微生物PCR檢測技術的前處理方法。

背景技術

在最近的研究中，通過PCR檢測不同種類的微生物，對微生物進行直接定性測試已經是常見的研究方法，尤其是環境中常見的細菌等微生物，都需要對菌體進行24小時培養，整體檢測時間需要1～2天。

環境中常見的微生物有葡萄球菌屬、鏈球菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、霍亂、弧菌、大腸桿菌等致病菌以及一些無致病功能的菌體。尤其是在牲畜養殖場的環境中，大腸桿菌、沙門菌屬、葡萄球菌屬等是最常出現的菌群，這些菌群出現在溫血動物腸道中引起腸粘膜細胞水與電解質的代解紊亂，是導致幼畜腹瀉的主要病因之一。這些菌群在牲畜中主要的傳染途徑是通過食入了被污染的飼料所致，由于養殖業的特點，飼料都是散放于養殖的環境中的，所以對環境中，特別是牲畜養殖場中的致病菌的及時、準確的檢測就顯得非常重要。

聚合酶鏈式反應技術（Polymerase?chain?reaction,PCR）是近年來分子生物學領域中迅速發展和廣泛應用的一種技術，能夠快速、準確地在體外上百萬倍的擴增目的基因或DNA片段?，F在應用的PCR技術能在48h內實現對環境中常見致病菌的快速、準確檢測，結果與鑒別培養沒有明顯差異；但是在應對突發性病變時，這種技術需要依靠細菌培養和DNA的提取，操作較復雜，耗時長。而且在PCR擴增過程中，樣本中含有大量雜質，且細菌量在不同樣本中的差別明顯，直接檢測可能出現嚴重的假陰性情況，干擾實驗結果。同時，樣本中DNA的質量在PCR檢測中非常重要，除菌群濃度高低外，緩沖液中離子濃度也會對DNA的質量造成影響，從而直接影響PCR的擴增結果。

發明內容

本發明提供一種無需經過DNA提取即可進行PCR檢測，且可減少檢測所需時間、簡化檢測步驟、提高PCR檢測效率的環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法，主要由以下步驟構成：

（1）獲得樣本；

（2）過濾：將樣本用雙蒸水混勻后過濾，過濾后的液體再用濾紙過濾，得到過濾液；

（3）離心：將過濾液于8500×g～12000×g的離心條件下離心；

（4）洗滌：離心后的沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌；

（5）稀釋：采用磷酸鹽緩沖液對洗滌后的沉淀進行稀釋，稀釋后菌液濃度不小于1.5×10³CFU/ml，稀釋后的菌液即進行PCR檢測。

進一步，所述常見微生物為革蘭氏陰性菌、葡萄球菌、鏈球菌或菌肺炎雙球菌。

為了更好的實現本發明，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.05M～0.2M。

作為一種優選，所述樣本采自養殖場環境中。

作為最優的實施方式，所述步驟（5）中稀釋后菌液濃度不小于3.12×10³CFU/ml。

本發明與現有技術相比，具有以下優點及有益效果：

（1）本發明處理后獲得的菌液，無需再經過培養基培養和DNA提取的過程，可直接進行PCR檢測，簡化了檢測步驟，減少實驗所需時間，可在4小時內獲得檢測結果；

（2）本發明處理后的菌液與其他方法處理后的菌液相比，當其進行PCR檢測時，其檢測效率明顯提高；

（3）本發明采用8500×g～12000×g的離心條件離心，可保證有效的分離出致病菌；

（4）本發明采用雙重過濾以及緩沖液洗滌沉淀的方法，可基本排除樣本中影響PCR反應的影響因子，使檢測結果更準確；

（5）本發明中稀釋后的菌液濃度不小于1.5×10³CFU/ml，保證有效的檢測出擴增條帶，使檢測的結果更準確；

（6）本發明采用濃度為0.05M～0.2M的磷酸鹽緩沖液，有效避免磷酸鹽緩沖液中的離子對DNA的質量造成影響。

附圖說明

圖1為樣本中大腸埃希菌的PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。

圖2為純的大腸埃希菌PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。

圖3為樣本熱裂解法PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。

圖4為樣本細菌漂浮法PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。

圖5為樣本增菌后PCR擴增樣本敏感性比較1%凝膠電泳圖。

圖6為樣本中豬霍亂沙門氏菌PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。

圖7為樣本中金黃色葡萄球菌PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。