[發明專利]一種轉基因水稻T1C-1表達的Cry1C蛋白的致敏性評價方法

無效

• 申請號: 201210089374.6
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN103364563A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 唐雪明;趙凱;施偉;韓芳婷;任方方;吳瀟;王金斌;何建華;蔣瑋
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院;上海師范大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

技術領域

本發明屬于生物安全領域，具體涉及一種轉基因水稻T1C-1表達的Cry1C蛋白致敏性的安全評價方法。

背景技術

轉基因植物從誕生以來，其食用安全性一直是科學界、政府和廣大消費者關心的焦點問題。至今，除了轉巴西堅果基因大豆有致敏性，轉GNA基因馬鈴薯的安全性有爭議外，其他許多的轉基因食品已被現在的研究結果證明是安全的，但轉基因食品的長期效應應有待探討，能夠批準一種新的轉基因食品的指標體系還有待進一步完善。目前，轉基因食品安全性評價的程序基本上包括五個方面：1)新基因產品的特性的研究；2)分析營養物質和已知的毒素含量的變化；3)潛在致敏性的研究；4)轉基因食品與動物或人類腸道中的微生物群進行基因交換的可能及其影響；5)活體和離體的毒理和營養評價。

轉基因食品與傳統食品最主要的差異在于前者含有用基因工程技術導入的外源基因及其表達產物-蛋白質，由于外源基因因編碼蛋白是傳統食品所不含有的新成分，因而成為人體過敏原的危險性很大。因此，轉基因食品致敏性評價是安全性評價中的一項十分重要的內容。目前，國際上大多采用世界糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)所制定的評價體系評價轉基因食品的致敏性。該評價體系中一項重要的評價原則是個案評價原則，指對不同的轉基因生物(材料)應進行逐個評估的原則，即不能將某一類特定轉基因生物或產品進行生物安全評價的結果和結論，任意和無原則地拓展到其他類型的轉基因生物及其產品上，所以，對轉基因食品的致敏性評價必須以個案評價原則為基礎。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis?Berliner，簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌，是目前研究最為深刻、應用最為廣泛的微生物殺蟲劑。它能產生對多種昆蟲或無脊椎動物有害的毒素，其中，最常見的Bt毒素是殺蟲晶體蛋白(Insecticidal?Crystal?Proteins，ICPs)，也稱δ-內毒素(delta-endotoxin)，于芽胞形成期在菌體的一端或兩端形成，Bt的殺蟲大多或完全依賴于ICPs(依昆蟲而定)，其中，cry1c蛋白就是ICPs的一種，產生的cry1c蛋白能用于殺蟲實驗及轉基因植物的抗蟲防護。例如，將Cry1C基因轉入到水稻中來控制鱗翅類害蟲，但對這種轉基因大米是否對人體無害還不清楚。癌癥研究院通過對小鼠進行高劑量的填喂法喂養，每千克的老鼠填喂5g的Cry1C蛋白，研究顯示Cry1C蛋白不會對老鼠引起不良反應，且在體外的模擬的腸胃液中快速降解。ICR小鼠填喂Cry1C蛋白后進行急性經口毒性試驗，經變性梯度凝膠電泳分析顯示：Cry1C蛋白對小鼠是無害的。但是，目前為止，沒有報道對Cry1C蛋白的致敏原性進行研究。Cry1C蛋白的蛋白序列具有高度的特異性，因此，Cry1C基因在廣泛應用于水稻之前，有必要對Cry1C蛋白進行安全性評價，特別是建立起動物模型來評價Cry1C蛋白的致敏原性成為研究者的重要任務。

發明內容

本發明的目的在于提供一種轉基因水稻T1C-1表達的Cry1C蛋白的致敏性評價方法，將轉基因水稻T1C-1表達的Cry1C蛋白序列與已知的過敏原或毒素序列進行序列同源性分析，檢測分析了Cry1C蛋白對胃蛋白酶的消化穩定性，并建立了動物致敏原性模型。

本發明中由于在轉基因水稻T1C-1中Cry1C蛋白含量低，所以，本發明將轉基因水稻T1C-1中的Cry1C基因連接到pET30a-質粒上，然后轉化到大腸桿菌中進行表達，再經純化和重折疊，最終從大腸桿菌中獲得足夠的Cry1C蛋白用于體外和動物研究中，從而評價Cry1C蛋白在人類食物和動物飼料中的致敏性。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明所述轉基因水稻T1C-1表達的Cry1C蛋白的致敏性評價方法，具體包括如下步驟：

1、將轉基因水稻T1C-1表達的Cry1C蛋白序列與已知的過敏原和毒素蛋白序列進行序列同源性比對分析，其中，Cry1C蛋白序列如SEQ?ID?NO?1所示。

2、轉基因水稻T1C-1表達的Cry1C基因在大腸桿菌中表達