[發明專利]基于熒光偏振的EGFR基因啟動子甲基化狀態均相檢測法

有效

• 申請號: 201210089332.2
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN102618645A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 張菊;姜英浩;梁平;王萌;強少盈;顏真
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 黃秦芳

1.一種用于測定樣品中EGFR基因啟動子甲基化狀態的均相檢測法，所述均相檢測法包括下列步驟：（1）從樣品中得到提取物：使用一種試劑或試劑盒從待測樣品中提取基因組DNA，再用另一種試劑或試劑盒處理基因組DNA并純化，得到純化的提取物；（2）擴增結合：將上述純化的提取物加入反應試劑進行擴增結合，所述反應試劑包括10倍的PCR緩沖液,濃度各為?2.0～2.5mmol/L的dNTP，2.0～3.5mmol/L的MgCl，1-5U/μl的TaqDNA聚合酶，濃度為0.5-2.0μmol/L的EGFR基因的啟動子靶CpG島區甲基化和非甲基化上游引物、下游引物，以及濃度為0.05-0.2μmol/L的靶基因的5’端帶熒光標記的探針，所述反應條件是：94-95℃變性4-10min后，95℃孵育5-40秒，55-65℃孵育15-60秒，72℃孵育10-60秒，35-45個循環，最后室溫15-30℃孵育；（3）：檢測：檢測反應溶液的熒光偏振FP值，SPSS軟件計算FP均值(means)和標準差(S.D.)，t檢驗統計陰性、陽性對照反應終液FP值分布，陽性臨界值Cut-off=陰性對照FP均值(means)-陰性對照FP標準差(S.D.)，陰性臨界值Cut-off=陰性對照FP均值(means)+陰性空白對照FP標準差(S.D.)，待測樣品FP值與Cut-off值比較即知靶區域CpG位點甲基化狀態：待測樣品FP值>陰性臨界值?Cut-off值，靶區域CpG位點為非甲基化狀態,待測樣品FP值＜陽性臨界值Cut-off值，靶區域CpG位點為甲基化狀態,陽性臨界值Cut-off值＜待測樣品FP值＜陰性臨界值Cut-off，則靶區域CpG位點甲基化狀態無法判斷，需重新檢測。

2.權利要求1?的檢測法，其中步驟（1）包括：在試劑或試劑盒中進行處理獲取基因組DNA；以及將所述基因組DNA在試劑或試劑盒中進行處理，通過化學反應，使未發生甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，發生了甲基化的胞嘧啶保持不變，將有無甲基化修飾的差異轉變為核苷酸序列的差異；其中所述獲取基因組DNA的試劑或試劑盒為內含蛋白酶K、細胞裂解液的DNA提取液，及內含酚／氯仿、乙醇或DNA純化用DEAE樹脂或DNA吸附柱的試劑；其中所述處理基因組DNA的試劑或試劑盒為內含過硫酸氫鈉(NaHSO3)的試劑或試劑盒，回收的DNA通過PCR來擴增，在PCR擴增過程中，5′位置上甲基化的胞嘧啶保持完整。

3.權利要求1或2的檢測法，其中所述引物為EGFR基因的啟動子靶CpG島區甲基化和非甲基化通用的上游引物、下游引物，所述5’端帶熒光標記的探針為EGFR基因的啟動子靶CpG島區甲基化同源的探針，能夠與所獲得的擴增子結合以產生能夠檢測的熒光偏振值變化；熒光偏振儀檢測所述各反應終液以獲得熒光偏振測量值；以及將熒光偏振測量值與特征性熒光偏振數值相比較，所述特征性熒光偏振數值為陰性對照反應終液FP均值、Cut-off值。

4.權利要求1或2的檢測法，根據待測EGFR基因的啟動子DNA序列，避開CG位點設計通用引物，其中所述覆蓋EGFR基因的啟動子靶CpG島區甲基化和非甲基化通用上游引物、下游引物序列為：正向引物5'-ggttttttgattttgtttagtattg-3'，反向引物5'-ccttacctttcttttcctcc-3',探針序列為5'-ttgggagagtcggagcgagttt-3'，或5'-ttcggggagtagcgatgcgatt-3'，或5'-agtcggagcg?agtttttcggg-3'，或5'-gagtagcgatgcgatt-3'，或5'-tttcgggacggtcggggt-3'，或5'-agcgtttttggcgttgt-3'，或?5'-ttgcgttttgttcggcgagtcgggt-3'。

5.權利要求1或2?的檢測法，其中所述末端標記的熒光素為TAMRA（四甲基羅丹明），或FAM（羧基熒光素）、R110（羅丹明）、FITC（異硫氰酸熒光素）、TET（四氯熒光素）、HEX（六氯熒光素）、ROX?、BTR。