[發明專利]嗜酸性喜溫硫桿菌的基因無痕敲除和整合方法

無效

• 申請號: 201210089108.3
• 申請日: 2012-03-29
• 公開（公告）號: CN102604929A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 林建群;吳燕;張成家;林建強
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種無痕敲除嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因或將外源基因插入嗜酸性喜溫硫桿菌染色體的方法，步驟包括構建同源重組的自殺型質粒載體，在載體的多克隆位點處插入同源臂得到同源重組質粒，將構建的同源重組質粒通過化學轉化法轉入大腸桿菌SM10菌株，通過接合轉移法將同源重組質粒從E.coli?SM10菌轉入嗜酸性喜溫硫桿菌中，平板篩選單交換子并進一步鑒定，構建大范圍核酸內切酶I-SceI的表達質粒并用電轉化法轉入單交換子中，平板篩選雙交換子并進一步鑒定；

其中：

所述自殺型質粒載體是pSDUDI，質粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；

所述同源重組質粒是pSDUDI-ΔsoxYZ，將其從E.coli?SM10菌轉入嗜酸性喜溫硫桿菌中的方法是：將收集到的E.coli?SM10和嗜酸性喜溫硫桿菌菌液按照1∶3的比例混合后，取50ul滴到接合平板上的濾菌膜上，37℃放置48h后，用5mL洗滌液洗滌濾膜，得到的細胞懸液梯度稀釋后涂布加入卡那霉素的Starky-Na₂S₂O₃固體培養基上，37℃，培養7～10天；

所述平板篩選單交換子并進一步鑒定的方法是：挑取篩選平板上的菌落，溶于無菌水中，取菌液為模板，使用引物oriT?EcoR?sen和oriT?Sal?ant特異性擴增自殺型質粒載體上接合轉移基因oriT，并以野生型菌株染色體為模板作為陰性對照，以質粒pSDUDI-ΔsoxYZ為模板作為陽性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，正對照所在的泳道會產生740bp的PCR產物條帶；負對照在相應的區域則無PCR產物條帶；挑取的驗證樣品中，若在相應區域產生與正對照相似的條帶，為單交換子，若無條帶產生與負對照相似，為假陽性；對單交換子進一步鑒定方法是：提取單交換子染色體，在被敲除基因的同源臂外側設計引物2520YANZH?sen和2520YANZH?ant用PCR擴增，并以野生型菌株染色體為陰性對照，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示以單交換子染色體為模板PCR擴增得到的條帶比陰性對照大7～8Kb，則進一步確定是單交換子，若無，則為假陽性；

上述引物序列是：

oriT?EcoR?sen：ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCG

oriT?Sal?ant：TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG

2520YANZH?sen：CCGGGTTCCTGGTAAGTC

2520YANZH?ant：GCTTACTGGCACTGCGATTA

所述大范圍核酸內切酶I-SceI的表達質粒是pSDU1-I-SceI，質粒pSDU1-I-Sce?I的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；

所述表達質粒電轉化法轉入單交換子中的電轉化參數是：電壓10,500V/cm；電阻400Ω；電容：25μF；

所述平板篩選雙交換子方法是：電轉化后將菌懸液加入到Starky-S⁰液體培養基中，37℃，50～60rpm過夜培養后加入氯霉素，轉速提高到100～120r/min再培養36-60h后，梯度稀釋涂布于加入氯霉素的篩選平板上，37℃倒置培養10～15天；在篩選平板上挑取菌落，在被敲除基因上下游150～250bp處設計引物2520test?sen和2520test?ant，用菌落PCR擴增，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示只在300～500bp處有目的條帶，則初步判斷是雙交換子；

上述引物序列是：

2520test?sen：AAATTGCGGAAAGTCTCG

2520test?ant：TGGGTATCGGTGATGTGC

所述雙交換子的進一步鑒定方法是：將篩選到的雙交換子菌落培養后提取染色體，在被敲除基因同源臂的外側設計引物2520YANZH?sen和2520YANZH?ant?PCR擴增驗證被敲除基因上下游區域，以雙交換子染色體為模板用PCR擴增，并以野生型菌株染色體為陰性對照，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示以雙交換子染色體為模板擴增得到的產物比陰性對照小，且差值是被敲除基因的大小，則進一步確定是雙交換子。